Brjóstkirtillinn er greinótt líffæri sem skiptist í bleðla og samanstendur af
tvískiptri þekju af hollægum þekjufrumum og vöðvaþekjufrumum.
Grunnhimnan, sem meðal annars er rík af kollagen IV, skilur þekjuna frá
bandvefnum í kring en í honum má finna æðaþel, bandvefsfrumur og
ónæmisfrumur. Brjóstkirtill kvenna nýtur sérstöðu þar sem meirihluti
þroskaferils hans á sér stað eftir að fósturskeiði er lokið, aðallega á
kynþroskaskeiði, en kirtillinn lýkur ekki fullum þroska fyrr en á meðgöngu. Við
þetta greinast kirtileiningar í bleðlum enn frekar og mjólkurmyndandi
þekjueiningar myndast. Vísir að þessu ferli á sér stað í hverjum tíðahring
þegar kirtillinn býr sig undir mögulega meðgöngu og því skiptast á tímabil
uppbyggingar og niðurbrots á meðan á frjósemistímabili kvenna stendur.
Þessu ferli er viðhaldið af stofnfrumum og þekjuforverum sem sérhæfast í
hollægar kirtilþekjufrumur eða vöðvaþekjufrumur ásamt því að viðhalda eigin
stofnum. D492 er frumulína með stofnfrumueiginleika sem einangruð var úr
eðlilegum brjóstvef. Frumulínan getur myndað frumur sem hafa hvor um sig
eiginleika kirtilþekju og vöðvaþekju og myndar þyrpingar með greinótta
formgerð í þrívíðri rækt. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að báðar svipgerðir eru
nauðsynlegar fyrir greinótta formgerð í þrívíðum þyrpingum D492
frumulínunnar. Þar að auki er bandvefsumbreyting þekjufrumanna í kirtlinum
nauðsynleg til að frumurnar geti skriðið inn í umlykjandi stoðvef og myndað
greinótta formgerð. Ýmsir þættir koma að stýringu greinóttrar formgerðar,
bandvefsumbreytingar og frumusérhæfingar í þekju brjóstkirtilsins. Í
doktorsverkefni mínu beindi ég sjónum að ncRNA sameindum og
grunnhimnuþættinum peroxidasin (PXDN) og notaði D492 frumulínuna ásamt
dótturlínunni D492M, sem hefur bandvefseiginleika, til að rannsaka hlutverk
þessara þátta í fyrrnefndum ferlum.
Í fyrstu greininni rannsökuðum við hlutverk miR-203a í
bandvefsumbreytingu í D492/D492M frumumódelinu og greinóttri formgerð í
iv
D492. Niðurstöður sýndu að tjáning miR-203a eykst í samræmi við myndun
greinóttrar formgerðar. Einnig kom í ljós að tjáning miR-203a er lítil sem
engin í D492M miðað við D492 en yfirtjáning á miR-203a í D492M leiddi að
hluta til viðsnúnings á bandvefsumbreytingu með aukinni tjáningu á luminal
og basal markerum. Einnig kom í ljós að í D492MmiR-203a dró mest úr tjáningu
PXDN. Við staðfestum síðar að PXDN er markgen miR-203a sem binst við
bindiset á 3‘UTR próteinsins og veldur þar með niðurtjáningu.
Önnur greinin segir frá meginrannsókn doktorsverkefnisins sem beindist
að PXDN próteininu, sem myndar krosstengi á milli kollagen IV sameinda, og
hlutverki þess í frumusérhæfingu og myndun greinóttrar formgerðar í D492.
Yfirtjáning á PXDN í D492 sýndi að próteinið ýtti undir ósérhæfða basal
svipgerð og dró um leið úr kirtilþekju- og vöðvaþekjusérhæfingu. Þetta leiddi
til hindrunar á myndun greinóttrar formgerðar þar sem þörf er á bæði
vöðvaþekju og kirtilþekju. Jafnframt kom fram aukin tjáning á
umritunarþættinum p63, sem þekkt er að viðheldur basal svipgerð í
brjóstaþekju. RNA raðgreining sýndi að auki að gen sem taka þátt í ferlum
tengdum sérhæfingu og þroskun þekjuvefja voru með aukna tjáningu en að
sama skapi var virkni í bandvefsumbreytingu þekjuvefjar, sem er
nauðsynlegur ferill í greinóttri formgerð, verulega skert. Niðurstöður
rannsóknarinnar sýndu fram á áður óþekkt hlutverk PXDN í frumusérhæfingu
í brjóstkirtlinum en genið hafði fram til þessa ekki verið skoðað í þessu tilliti.
Í þriðju greininni var hlutverk lncRNA sameindarinnar MEG3 í
bandvefsumbreytingu og frumusérhæfingu í D492/D492M frumumódelinu
kannað. Þar kom í ljós að MEG3 er bundið við bandvefslíka svipgerð en
tjáning þess var marktækt hærri í bandvefslíkum frumulínum miðað við
þekjufrumulínur. Við yfirtjáningu á MEG3 í D492 varð svipgerðarbreyting í átt
að basal svipgerð ásamt marktækri aukningu á bandvefslíkum eiginleikum og
meðfylgjandi aukinni tjáningu á bandvefskennipróteinum. Þar að auki dró úr
greinóttri formgerð í D492MEG3. Við niðurslátt á MEG3 í D492M varð
viðsnúningur á bandvefsumbreytingu og þekjueiginleikar jukust, þó aðeins í
átt að kirtilþekjusvipgerð. Þessar niðurstöður voru staðfestar með RNA
v
raðgreiningu sem sýndi fram á að dregið hafði úr virkni bandvefsumbreytingar
samfara niðurtjáninu á bandvefsgenum og aukningu á kirtilþekjugenum.
Til samantektar varpaði ég ljósi á hlutverk ncRNA sameindanna MEG3 og
miR-203a í bandvefsumbreytingu, frumusérhæfingu og greinóttri formgerð í
D492 og D492M en einnig bar ég kennsl á PXDN sem markgen miR-203a. Í
framhaldinu sýndi ég fram á að PXDN, sem hingað til hefur ekki verið
rannsakað í brjóstaþekju, eykur basal svipgerð í D492 en dregur úr
frumusérhæfingu og hindrar myndun greinóttrar formgerðar í D492.
The mammary gland is a branched, lobular organ comprised of terminal duct
lobular units (TDLUs) that contain bilayered epithelium of inner luminal cells
and outer myoepithelial cells. The basement membrane, with collagen IV as
the chief component, separates the epithelium from the surrounding stroma
which is rich in fibroblasts, microvessels, and immune cells. The human
female mammary gland is unique as its main developmental period occurs
long after birth during puberty, and full maturity is not reached until pregnancy
where branching is increased, and milk-producing units are formed.
Furthermore, the gland undergoes cyclical changes during each menstrual
cycle in preparation for a possible pregnancy, where the epithelium expands
and is subsequently broken down if pregnancy does not occur. This process
is maintained by epithelial stem cells and progenitor cells that differentiate
into luminal and myoepithelial cells in addition to maintaining their population.
D492 is a breast epithelial cell line with stem cell properties, isolated from the
suprabasal subpopulation of normal breast epithelium. The suprabasal
population is believed to contain mammary stem cells, reflected in the ability
of D492 cells to undergo branching morphogenesis when cultured under
three-dimensional conditions. These branching structures resemble the
TDLUs of the breast and require plasticity of D492 cells which can form
populations of cells with luminal and myoepithelial characteristics. In addition
to epithelial plasticity, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a central
process in branching morphogenesis in the breast, as epithelial cells require
mesenchymal characteristics to be able to migrate into the surrounding
matrix when branches are being formed. A myriad of factors is involved in the
control of branching morphogenesis, EMT, and epithelial differentiation within
the breast. In my Ph.D. project, I applied the D492 cell model along with its
mesenchymal daughter cell line D492M and focused on the role of the
ncRNAs MEG3 and miR-203a and the basement membrane factor
peroxidasin (PXDN) in these processes.
viii
The first article focused on the role of microRNA (miRNA) miR-203a in
EMT in D492 and D492M in addition to branching morphogenesis in D492.
Small RNA sequencing revealed that miR-203a expression is increased
during branching with increased colony complexity and cell differentiation.
Furthermore, we found that miR-203a was significantly less expressed in
D492M compared to D492. Overexpression of miR-203a in D492M lead to
partial mesenchymal-to-epithelial transition (MET) with upregulation of both
luminal and basal markers. We also found that PXDN was the most
downregulated gene in D492MmiR-203a. Subsequently, we confirmed that miR-
203a targets the 3‘UTR of PXDN, resulting in post-transcriptional
downregulation.
In the second article, I present data which were the main focus of my
Ph.D. project, the collagen IV crosslinker PXDN and its role in epithelial
differentiation and branching morphogenesis in D492. Overexpression of
PXDN in D492 eliminated the luminal and myoepithelial phenotype while
inducing undifferentiated basal phenotype, thereby negatively affecting
plasticity that is characteristic for the D492 cell line. This led to complete
inhibition of branching morphogenesis. I also present evidence that induction
of basal phenotype in D492PXDN cells is mediated through upregulation of
p63, which maintains basal phenotype in breast epithelium. Furthermore,
RNA-sequencing reveals significant enrichment in pathways involved in
epithelial differentiation and development in D492PXDN while EMT, a
significant pathway involved in branching morphogenesis, is significantly
downregulated.
In the third article, the role of the long non-coding RNA (lncRNA) MEG3 in
EMT and epithelial differentiation in D492 and D492M was explored. Results
showed that MEG3 expression was associated with mesenchymal phenotype
and was significantly higher in mesenchymal cell lines. Overexpression of
MEG3 in D492 was accompanied by increased basal and mesenchymal
features and reduced branching morphogenesis. With knock-down of MEG3
in D492M partial MET was observed with an increase in epithelial markers
but only towards the luminal phenotype. Results from D492M were confirmed
ix
by RNA sequencing which showed that the EMT pathway was downregulated
with simultaneous downregulation of mesenchymal genes and upregulation
of luminal markers
To summarize, I investigated the role of ncRNAs MEG3 and miR-203a in
EMT, epithelial differentiation, and branching morphogenesis in the D492 and
D492M cell lines. Furthermore, I identified PXDN, a collagen IV crosslinker
previously unexplored in the mammary gland, as a target of miR-203a.
Subsequently, I showed that PXDN induces basal phenotype and stemness
with a simultaneous reduction in differentiation and inhibition of branching
morphogenesis in D492. In addition, I showed that this effect was elicited
through the p63, presenting a novel link to PXDN.
