Identification of primary cells, such as mesenchymal stromal cells, at the molecular level is vital for better understanding of their differentiation pathways. Surface-enhanced Raman scattering has a potential to become a non-invasive screening method for characterization of biomolecules, including their dynamic changes in conformation, distribution, and interactions. However, the lack of appropriate SERS substrates, cell monitoring protocols and difficulties in translation of the SERS spectral information into widely understandable data are a reason why SERS is not yet extensively used. This thesis focuses on the development of a surface-enhanced Raman scattering platform for continuous screening of cells and their processes. This platform was used specifically for studying osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) determined from changes occurring on the cell membranes during differentiation. SERS substrates were fabricated on glass supports by repeated thin gold films deposition and thermal annealing, which resulted in wide diversity of gold nanoisland sizes and homogeneous distribution of “hot spots”. In order to ensure high and uniform signal enhancement across large areas, numerical simulations and experimental assessments of enhancement factors were performed, indicating the enhancement factors of the order of 10^6 are uniformly distributed across the substrate’s area. Moreover, the SERS substrate’s biocompatibility was confirmed by viability assays and immunofluorescence staining, which clearly verified that the presence of the SERS substrates does not hamper cell propagation. The applicability for long-term cell proliferation and SERS screening was demonstrated by culturing MSCs and recording spectra of cellular membrane at different timepoints during differentiation, simultaneously confirming the osteogenic phenotype with standard methods. The results indicate that SERS culturing platform can be used to investigate the composition of cell membranes during osteogenic differentiation, combining imaging of cells with spectroscopic detection of molecular species and chemical events occurring on the cellular membrane adjacent to the surface of the SERS substrate, without disturbing the cells. In addition, SERS substrates were used for live-cell imaging of a fibroblast cell line, further indicating that the SERS substrates and optical excitation conditions do not adversely affect live cells, paving a way towards continuous label-free screening of osteogenic differentiation of live mesenchymal stromal cells.
Til að skilja betur þá sameindafræðilegu ferla sem stýra sérhæfingu mannafruma, eins og
t.d. mesenkímal bandvefsfruma, er mikilvægt að búa yfir viðeigandi greiningartækni. Meðal
mögulegra leiða til að rannsaka slíkar frumur án inngrips er yfirborðsmögnuð Raman
ljósdreifing (SERS) en með henni má greina lífrænar sameindir, staðsetningu þeirra,
uppbyggingu og víxlverkun þeirra á milli. Þessi aðferð hefur þó náð takmarkaðri útbreiðslu
þar sem skortur er á viðeigandi yfirborðum og samhæfðum mæliaðferðum, auk þess hve
erfitt er að þýða litrófsupplýsingarnar yfir í nýtanleg gögn. Þessi ritgerð fjallar um þróun
yfirborða sem gefa möguleika á að framkvæma samfelldar mælingar á frumum og þeim
sameindalífræðilegu ferlum sem eiga sér stað innan þeirra. Aðferðafræðin var nýtt
sérstaklega til að rannsaka beinsérhæfingu mesenkímal bandvefsfruma með því að fylgjast
með breytingum sem áttu sér stað í frumuhimnu við sérhæfinguna. SERS-virk yfirborð voru
útbúin á glerþynnum með endurtekinni húðun og hitameðhöndlun örþunnra laga af gulli.
Sýnt var fram á framleiðsluaðferðin skilaði yfirborðum með breiða stærðardreifingu
gullagna í nanóstærð og jafna dreifingu sterkrar yfirborðsmögnunar innfallandi
rafsegulgeislunar. Tölulegir útreikningar á mögnunarstuðlum voru framkvæmdir til að
tryggja háa og jafndreifða mögnun litrófsmerkis yfir stærri svæði. Niðurstöður útreikninga
voru staðfestar með tilraunum sem sýndu fram á allt að milljónfalda mögnun Raman
ljósdreifingar við yfirborðin. Lífsamhæfni yfirborðanna var sannreynd með lífvirkniprófum
og flúrljómunarlitun sem staðfestu að yfirborðin sýndu eðlilegan frumuvöxt og fjölgun.
Gagnsemi yfirborðanna við rannsóknir á frumum yfir lengra tímabil var staðfest með því að
fylgja eftir breytingum í Raman-rófum frá frumuhimnum mesenkímal bandvefsfruma við
beinsérhæfingu. Svipgerð frumanna var staðfest samhliða með stöðluðum aðferðum.
Niðurstöður rannsóknana staðfestu að yfirborðin sem þróuð voru nýtast vel til að fylgja eftir
breytingum í samsetningu frumuhimna við beinsérhæfingu þar sem þau sameina
smásjármyndatöku og litrófsgreiningu sem birtir efnasamsetningu og efnabreytingar við
frumuhimnu, án inngrips. Yfirborðin voru einnig nýtt til rannsókna á lifandi
trefjakímfrumum sem gáfu frekari staðfestingu á því að hvorki yfirborðin sjálf né ljósörvunin
hefðu neikvæð áhrif á frumurnar. Aðferðir þær sem kynntar eru hér gefa því fyrirheit um að
þær megi nýta til að fylgjast með ýmsum frumubreytingum, svo sem beinsérhæfingu lífandi
mesenkímal bandvefsfruma, í rauntíma og án inngrips.
