Studying human metabolism is crucial for the understanding of diseases and
improvement of therapy as metabolic alterations are central to a number of
human diseases. A variety of experimental disciplines, such as biochemistry,
biophysics and systems biology are involved in the elucidation of metabolic
pathways. The work presented in this thesis is divided into three main
studies, which expand the knowledge of human metabolism using systems
biology and biochemical techniques.
In the first study presented in this thesis, constraint-based modeling was
used to investigate metabolic changes during epithelial to mesenchymal
transition (EMT), which is a developmental process where epithelial cells dedifferentiate
into mesenchymal-like cells. Dysregulation of EMT has been
associated with cancer metastasis. Context-specific genome-scale metabolic
models were derived from a generic human metabolic model using
transcriptomic and extracellular metabolomics data from isogenic breast
epithelial cell lines (D492 and D492M), which allowed in silico predictions of
the metabolic changes during EMT. The models revealed differences in the
central carbon metabolism along with different utilization of amino acids in the
two cell lines. In silico gene essentiality analysis predicted that components
of the SLC7A5 subunit of the large neutral amino acid transporter LAT1 was
exclusively essential for mesenchymal cell survival. This study presented a
platform for further studies on EMT. Further, the predicted metabolic targets
can aid the development of novel cancer therapeutics.
In the second study, the effects of a novel human metabolic enzyme,
gluconokinase, was investigated. Despite the presence of gluconate in
human bio-fluids and its widespread use in food and pharmaceutical industry,
the details of gluconate metabolism in humans is relatively unexplored.
Reactions specific for consumption of gluconate were added to a red blood
cell metabolic model, in order to evaluate the impact of gluconate on human
metabolism. It was found that adding gluconokinase to the model affects
NADPH production in red blood cells, which in turn is closely associated with
oxidative stress regulation and fatty acid metabolism in the cells. The
computational simulations demonstrated that gluconokinase activity has
significant effects on the overall metabolism of the cell and is worth
investigating further.
In the final study, kinetic parameters of human gluconokinase were
determined using isothermal titration calorimetry (ITC) along with the
mechanism of the reaction. The results establish that the reaction follows a
ternary complex mechanism with ATP being the first binding substrate and
gluconate displaying substrate inhibition. This study demonstrated that ITC
could be used as a tool to determine mechanisms of enzyme catalyzed
reactions along with kinetic parameters.
The studies presented in this thesis emphasize that traditional
biochemical assays and advanced systems biology methods are
complementary tools, which allow a more complete understanding of human
metabolism.
Rannsóknir á efnaskiptum eru nauðsynlegar til að skilja undirliggjandi
forsendur sjúkdóma og til að efla lyfjameðferðir þar sem breytingar í
efnaskiptaferlum eru miðlægar í mörgum sjúkdómum. Margar
aðferðafræðilegar nálganir á borð við lífefnafræði, lífeðlisfræði og
kerfislíffræði eru notaðar til greininga efnaskiptaferlum. Þessari ritgerð er
skipt í þrjá hluta sem fjalla á ólíkan hátt um efnaskipti í mannafrumum með
kerfislíffræðilegum- og lífefnafræðilegum aðferðum.
Fyrsta rannsóknin fjallar um notkun skorðaðra efnaskiptalíkana til
rannsókna á breyttum efnaskiptaferlum við bandvefsumbreytingu (epithelial
to mesenchymal transition - EMT). EMT er vel þekkt ferli í fósturþroskun þar
sem þekjuvefs frumur umbreytast í bandvefslíkar frumur. Brenglun á EMT
ferlinu hefur verið tengt myndun meinvarpa í brjóstakrabbameinum. Sérhæfð
efnaskiptalíkön byggð á gögnum um genatjáningu og mælingar á upptöku og
seytingu næringarefna frá brjóstaþekjufrumulínunni D492 og bandvefslíkri
dóttufrumulínu hennar D492M. Með notkun þessara efnaskiptalíkana er
mögulegt að spá fyrir um breytingar í innanfrumu efnaskiptaferlum sem verða
við bandvefsumbreytingu. Líkönin benda til þess að munur sé í miðlægum
kolefnis efnaskiptum ásamt breytilegri nýtingu amínósýra milli frumulínanna
tveggja. Greiningu á lífsnauðsynlegum genum fyrir hvora frumulínu „in Silico“
bendir til þess að SLC7A5 undireiningin í LAT1 amínósýruferjunni sé
nauðsynlegur fyrir lifun bandvefslíkra frumna en ekki nauðsynlegur fyrir
þekjuvefsfrumur. Aðferðafræðin sem notast var við í þessari rannsókn getur
nýst við frekari rannsóknir á bandvefsumbreytingu. Gögnin sem kynnt eru í
þessari rannsókn má nýta til að spáð fyrir um ný möguleg lyfjamörk til
krabbameins meðferða.
Í annari rannsókninni er fjallað um nýlega skilgreint efnaskiptaensím í
mönnum, glúkonókínasa. Þrátt fyrir tilvist glúkonats í líkamsvessum og
útbreidd a notkun þess í matar- og lyfjaiðnaði, hafa efnaskipti glúkonats í
mönnum verið lítt rannsökuð. Efnahvörf sem miða að niðurbroti glúkonats var
bætt við efnaskiptalíkan rauðra blóðkorna til þess að meta vægi glúkonats í
efnaskiptum manna. Með því að bæta við efnaskiptaferlum fyrir niðurbrot
glúkonats komu fram breytingar á NADPH framleiðslu, sem er tengt við
stýringu oxunarálags og fitusýruefnaskiptum þeirra. Tölvulíkönin sýna fram á
að glúkonókínasa virkni hefur marktæk áhrif á efnaskiptaferla og er vert
frekari rannsókna.
Seinasta rannsóknin snýst um að mæla parametra hreyfiorkunnar fyrir
glúkónokínasa með skammtastilltri jafnhita-varmamælingu (ITC) ásamt
greiningu hvarfgangs. Niðurstöðurnar sýna að hvarfgangurinn myndar
þríundarklósamband við ATP sem fyrsta hvarfefni og að glúkonat sýnir
hvarfefnahindrun. Þessi rannsókn sýnir að skammtastillt jafnhitavarmamæling
getur verið gagnlegt til að ákvarða hvarfgang ensím-hvataðra
hvarfa ásamt því að skilgerina parametra hreyfiorkunnar.
Rannsókninar sem notaðar eru í þessari ritgerð renna stoðum undir að
hefðbundin lífefnafræði og kerfislíffræði eru samfallandi aðferðir sem leyfa
dýpri og öflugri skilning á efnaskiptaferlum.
