The immunomodulatory role of LL-37 in the pathogenesis of psoriasis

Abstract

Psoriasis is an autoimmune disease of the skin, and the most common form, plaque psoriasis, is characterized by raised, well-demarcated, erythematous plaques with adherent silvery scales. The immunopathogenesis has a mixed Th1 and Th17 inflammatory profile, and keratinocytes in the basal layer of the skin hyperproliferate and do not mature properly, causing elongated rete ridges and parakeratosis. Alterations in the immune biomarker microenvironment accompany the pathogenesis of psoriasis, both in skin and blood. LL-37 is an anti-microbial peptide of the innate immune system that has extensive immunomodulatory functions besides having an anti-microbial function. LL-37 takes part in the induction of psoriasis, with a potential role as an autoantigen. In this project, we wanted to further define the immunomodulatory effect of

LL-37 upon various immune biomarker secretion by keratinocytes and white blood cells.

Blood and skin samples were obtained from psoriasis patients undergoing phototherapy. When analysed, the results corroborated the role of T17 cells, both CD4+ and CD8+ T cells, in the pathogenesis of psoriasis, as the percentage of Th17 and Tc17 cells was reduced following phototherapy. In addition, the reduction of Th17 cells positively correlated with both PASI and the histological Trozak score. Within the skin, the number of T cells reduced with psoriasis treatment, and the intensity of immunofluorescent staining of

IL-17 in the dermis correlated to the PASI score. There was also a reduction in the percentage of skin-homing CLA+ T cells, both in T17 cells and T22 cells, as well as in CD103+CLA+ skin-homing T cells.

Further phenotypic analysis of these skin-homing T cells in psoriasis patients was performed by measuring the expression of the chemokine receptors CXCR3, CCR4, and CCR6. Two groups of CXCR3 expressing T cells were observed, expressing high or intermediate levels, and these two groups were subsequently analysed separately. Different chemokine receptor expression patterns emerged when T cells were subtyped based on the expression of CLA and CD103.

When peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated in vitro with two distinct stimulations mimicking the Th1 and Th17 microenvironment, various biomarker secretory patterns emerged, particularly in association with the presence of LL-37. Due to the differences in CXCR3hi expression of T cells between psoriasis patients and healthy controls (HC), their functional capacity was analysed further. CXCR3hiCD4+ T cells cultured using Th1 and Th17 stimulation, secreted lower levels of IL-10, CXCL8, and IL-1β than CXCR3negCD4+ T cells.

The pathogenesis of psoriasis is in part driven by the secretion of immune biomarkers by keratinocytes. Thus, given the above findings, investigation of their inflammatory profile in the same immunomodulatory microenvironment as for the PBMC was performed, focusing on LL-37. The results demonstrate that primary keratinocytes secrete a wide array of chemokines, growth factors, and cytokines that can be significantly affected by Th1 and Th17-driven stimulation. Furthermore, their immune biomarker fingerprinting was frequently altered in the presence of LL-37. In many instances, LL-37 reduced the secretion of immune biomarkers when added to Th1 stimulation as compared to Th1 stimulation alone. Under Th1 and Th17 inflammatory stimulation, LL-37 modulated the secretion of keratinocytes towards a more inflammatory response by increasing secretion of CXCL8 and IL-1β and decreasing secretion of IL-10. In addition, LL-37 also affected the intracellular signalling pathways of keratinocytes by decreasing the phosphorylation of ERK1/2. When the expression of LL-37 in psoriatic skin was analysed, a change in expression pattern of psoriasis patients was observed following treatment, from being distributed all over the epidermis to being defined to the basal layer as also was found in HC skin biopsies.

Taken together, this research details the changes in circulatory T cells and the microenvironment in psoriatic plaques, both at cellular and molecular levels, that occur concomitant to phototherapy. We document the secretory potential of PBMCs and keratinocytes of immune biomarkers after stimulation that mimics the psoriasis microenvironment. Furthermore, the immunomodulatory properties of LL-37 on secretion and intracellular signalling pathway activation are described, both in keratinocytes and PBMCs, as well as the biological expression of LL-37 in psoriatic skin. A more detailed understanding of the fundamental pathways that contribute to the pathogenesis of psoriasis is a driving force in more focused therapy. The effects of immunomodulatory agents such as LL-37 need to be mapped out in diverse biological mimicking situations, and we think that we have contributed to this field. This research adds to the basic knowledge regarding the pathogenesis of psoriasis, concerning cellular and molecular changes occurring following psoriasis treatment, and what effects different inflammatory microenvironments and LL-37 have thereon.

Sóri er sjálfsofnæmissjúkdómur sem herjar á húð og algengasta formið, skellusóri, lýsir sér sem upphleyptum, afmörkuðum, rauðleitum skellum með hvítleitu hrúðri. Meingerðin er blanda af Th1 og Th17 bólgusvari þar sem hyrnisfrumur í neðsta lagi húðarinnar fjölga sér of hratt og þroskast ekki rétt sem veldur þykknun á yfirhúðinni. Samsetning lífmerkja, bæði í húðinni og blóði, er öðruvísi í sórasjúklingum en í heilbrigðum einstaklingum. LL-37 er varnarpeptíð sem tilheyrir ósérhæfða ónæmiskerfinu og getur mótað ónæmissvarið, auk þess að geta drepið örverur sem komast inn í líkamann. LL-37 er í hærri styrk í sórasjúklingum en heilbrigðum einstaklingum, bæði í blóði og húð. LL-37 tekur þátt í upphafi meingerðar sóra og er mögulega sjálfsofnæmisvaki í sóra. Í þessu verkefni var markmiðið að skilgreina betur hvernig LL-37 mótar ónæmissvar og hefur áhrif á seytingu hyrnisfrumna og ónæmisfrumna á lífmerkjum.

Blóð- og húðsýni voru fengin frá sórasjúklingum sem voru í ljósameðferð við sóra. Eftir mælingu á sýnunum var tenging T17 frumna staðfest við alvarleika sóra, hjá bæði CD4+ og CD8+ T frumum, þar sem T17 frumum fækkaði við meðferð. Auk þess var jákvæð fylgni milli fækkunar á Th17 frumum í blóði og alvarleika sjúkdóms. T frumum fækkaði í húðinni og tjáning IL-17 í leðurhúðinni hafði jákvæða fylgni við alvarleika sjúkdóms. Hlutfall T frumna sem tjáðu húðsæknisameindirnar CD103 og/eða CLA minnkaði við ljósameðferð hjá bæði T17 og T22 frumum.

T frumur sem voru á leið í sórahúð voru skoðaðar nánar með því að mæla flakkboðaviðtakana CXCR3, CCR4 og CCR6. T frumur tjáðu CXCR3 í mismiklu magni og í úrvinnslunni var þeim skipt upp í tvo hópa eftir því hversu mikið þær tjáðu af CXCR3. Tjáningarmynstur T frumna á flakkboðaviðtökum var mismunandi eftir tjáningu þeirra á CLA og CD103.

Hnattkjarna frumur úr blóði voru einangraðar og örvaðar með bólguboðefnum sem líktu eftir Th1 og Th17 ónæmissvari. Seyting þeirra eftir örvun myndaði ólík tjáningarmynstur sem LL-37 hafði áhrif á. CXCR3hi T frumur voru misalgengar hjá sórasjúklingum og heilbrigðum einstaklingum og þar af leiðandi var ákveðið var að skoða þær frekar. CXCR3hiCD4+ T frumur sem voru einangraðar og örvaðar með Th1 og Th17 örvun seyttu minna af IL-10, CXCL8 og IL-1β en CXCR3negCD4+ T frumur.

Meingerð sóra er undir miklum áhrifum af seytingu hyrnisfrumna. Ákveðið var að rannsaka seytingu hyrnisfrumna við sömu örvunaraðstæður og áður var lýst fyrir hnattkjarna frumur úr blóði. Niðurstöðurnar gefa til kynna að hyrnisfrumur seyta fjöldanum öllum af flakkboðum, vaxtarþáttum og bólguboðefnum sem Th1 og Th17 örvun hafa mikil áhrif á. Að auki hefur LL-37 áhrif á seytinguna. Þegar LL-37 var notað með Th1 örvun þá dró það oft úr seytingu, miðað við Th1 örvun eingöngu.

Þegar hyrnisfrumur voru örvaðar með Th1 og Th17 örvun auk LL-37, þá stýrði LL-37 seytingunni í bólguhvetjandi átt með því að auka seytingu á CXCL8 og IL-1β og minnka seytingu á IL-10. LL-37 hafði líka áhrif á innanfrumu boðferla hyrnisfrumna með því að minnka fosfæringu á ERK1/2. Tjáning LL-37 var mismunandi í heilbrigðri húð og sórahúð þar sem tjáning LL-37 huldi alla yfirhúðina í ómeðhöndlaðri sórahúð. Eftir ljósameðferð dróst tjáningin saman og færðist nær neðsta laginu í yfirhúðinni, sem er líkara tjáningarmynstri LL-37 í eðlilegri húð.

Yfir það heila sýnir þessi rannsókn fram á breytingar sem verða á T frumum í blóðrás sórasjúklinga við ljósameðferð. Seytingu ónæmisfrumna og hyrnisfrumna og hvernig þær svara mismunandi örvunum sem líkja eftir bólguumhverfi sem sést í meingerð sóra eru gerð góð skil, sem og áhrifum ónæmismótandi peptíða eins og LL-37 á þá seytingu. Að auki er mótunaráhrifum LL-37 á innanfrumu boðferla í hyrnisfrumum og ónæmisfrumum lýst og tjáningarmynstur LL-37 í húðvef skoðað. Ítarlegri þekking á grunn ónæmissvarinu sem stuðlar að meingerð sóra er ómetanleg og mun gefa okkur nákvæmari skotmörk í lyfjameðferð. Við teljum að þessi rannsókn sé verðugt innlegg í þekkingargrunninn sem er að myndast um meingerð sóra, einkum hvað varðar breytingar sem verða samhliða ljósameðferð á seytingu mismunandi frumugerða á margs konar lífmerkjum, sem og áhrifa LL-37 á nærumhverfið í sóra.