Functional role of microRNAs in breast morphogenesis and epithelial to mesenchymal transition

Abstract

Brjóstkirtillinn er myndaður af greinóttum kirtilgöngum sem umluktir eru æðaþelsríkum bandvef. Brjóstakrabbamein á upptök í kirtilþekjufrumum í endum kirtilganga. Brjóstakrabbameinsfrumur nýta sér ferli sem kallast bandvefsumbreyting þekjuvefjar til að skríða í gegnum aðliggjandi bandvef. Í doktorsverkefni mínu rannsakaði ég genatjáningarmynstur brjóstastofnfrumulínunnar D492 í myndun greinóttrar formgerðar og bandvefsumbreytingu þekjuvefjar. D492 myndar kirtilganga og kirtilber í þrívíðri frumurækt sem líkjast því sem sést í brjóstkirtli. Þegar D492 er ræktuð í þrívíðri samrækt með æðaþelsfrumum þá eykst geta hennar til greinóttrar formmyndunar sem einnig getur leitt til óafturkræfrar bandvefsumbreytingar þekjuvefjar sem einkennist af breyttri formgerð, tapi á E-cadherin og keratín tjáningu samhliða aukinni tjáningu á N-cadherin. Búið er að einangra og rækta bandvefslíka dótturfrumulínu úr þrívíðum samræktum D492 og æðaþelsfruma sem við köllum D492M og sýnt hefur verið fram á að er upprunnin frá bandvefsumbreytingu þekjuvefjar. Í verkefninu notaði ég D492 og D492M frumulínurnar til að rannsaka genatjáningu á mismunandi stigum greinóttrar formgerðar og í bandvefsumbreytingu þekjuvefjar. Í fyrstu greininni sýndum við fram á mikinn mun í genatjáningu smásærra RNA sameinda (miRNA) milli D492 og D492M. Genatjáning sem einkennir þekjuvef er ríkjandi í D492 en genatjáning bandvefs er ríkjandi í D492M. Við greiningu miRNA tjáningar kom í ljós að mest minnkun í D492M var á tjáningu miRNA sem tilheyra miRNA-200 fjölskyldunni ásamt miR-203a og miR-205. Þessi miRNA gegna mikilvægu hlutverki í viðhaldi þekjuvefsformgerðar og minnkuð tjáning þeirra hefur verið tengd bandvefsumbreytingu þekjuvefjar. Þegar við yfirtjáðum miR-200c-141 í D492M (D492MmiR-200c-141) olli það umbreytingu frá bandvefsformgerð yfir í þekjuvefsformgerð. Þegar genatjáningarmynstur D492MmiR-200c-141 var skoðað kom í ljós að vöðvaþekjuvefs umritunarþátturinn ΔNp63 var ekki tjáður í D492MmiR-200c-141. Þegar við yfirtjáðum ΔNp63 í D492MmiR-200c-141 voru stofnfrumueiginleikar frumulínunnar endurheimtir, þ.e. frumulínan gat myndað bæði vöðvaþekjufrumur og kirtilber í þrívíðri frumurækt. Í megin grein doktorsverkefnisins var hlutverk miR-203a í greinóttri formgerð og bandvefsumbreytingu þekjuvefjar rannsakað. Í ljós kom að tjáning miR-203a í D492 eykst milli tímapunkta í þrívíðri rækt, þ.e. við myndun kirtilberjanna eykst tjáning miR-203a samhliða aukinni þroskun og sérhæfingu. Einnig var sýnt fram á að tjáning miR-203a er hverfandi í D492M í þrívíðri rækt og þegar miR-203a var yfirtjáð í D492M (D492MmiR-203a) breytist svipgerð að hluta til í átt til þekjuvefsfrumugerðar. Yfirtjáning á miR-203a í D492M leiddi til hægari frumufjölgunar, minnkaðrar getu til vaxtar í rækt án viðloðunar við fast yfirborð, hægara frumuskriðs og minni getu til ífarandi vaxtar. Niðurstöður á samanburði genatjáningar milli D492M og D492MmiR-203a leiddu til uppgötvunar á peroxidasin (PXDN) sem markgens miR-203a. PXDN getur myndað krosstengi í kollagen IV (COL4A1) sem er mikilvægt fyrir stöðugleika grunnhimnunar. PXDN hefur þrjá bindistaði fyrir miR-203a á 3‘-UTR svæðinu og var það staðfest með Lúsíferasa prófi. Í þriðju greininni sýndum við fram á mismikið næmi D492 og D492M við hindrun á prótín týrósín fosfatasa 1B (PTP1B). Hindrun á PTP1B truflaði millifrumutengi og olli frumudauða í D492 frumum. Athyglisvert er að D492M frumur voru næmari fyrir hindrun á PTP1B heldur en D492 og að þegar miR-200c-141 var yfirtjáð í D492M minnkaði næmi frumanna fyrir PTP1B hindrun. Tilgáta okkar var að PTP1B hindrun gæti mögulega komið að notum í meðferð við krabbameinum þar sem bandvefsumbreyting þekjuvefjar á sér stað. Samantekið þá notaði ég brjóstastofnfrumulínuna D492 og bandvefslíka dótturfrumulínu hennar D492M til að rannsaka tjáningu og hlutverk smásærra RNA sameinda (miRNA) í greinóttri formmyndun og EMT. Ég varpaði ljósi á hlutverk miR-200c-141 og miR-203a í þessum ferlum og uppgötvað PXDN sem nýtt markgen fyrir miR-203a. Einnig var sýnt fram á að hindrun á PTP1B hefur áhrif á millifrumutengi og veldur frumudauða í D492 og D492M frumum.

In this thesis, I investigated gene expression in branching morphogenesis and epithelial to mesenchymal transition (EMT) in D492, a breast epithelial progenitor cell line. D492 generates luminal- and myoepithelial cells and in three-dimensional reconstituted basement membrane matrix (3D-rBM) it generates structures reminiscent of the terminal duct lobular units (TDLUs) of the breast. When co-cultured with endothelial cells, subset of D492 cells undergo EMT, as is evidenced by a spindle shape morphology, E- to N-cadherin switch and a loss of keratin expression. We have established an endothelial-induced mesenchymal subline from D492 referred to as D492M. In my work, I used D492 and D492M cultivated in 3D-rBM as a model to investigate gene expression of noncoding RNAs (mainly miRNAs) and protein coding genes during different stages of branching morphogenesis and in EMT. MiRNAs expression analysis, between D492 and D492M, were done on cells from monolayer cultures and were performed using microarrays. Of the most downregulated miRNAs in D492M were members of the miR-200 family and miR-203a. I participated in elucidating the role of miR-200c-141 in branching and EMT by overexpressing these miRNAs in D492M. Characterization of D492MmiR-200c-141 demonstrated reversion towards the epithelial phenotype, albeit only to the luminal epithelial phenotype. It was further shown that the myoepithelial transcription factor ΔNp63 was missing from D492MmiR-200c-141. When ΔNp63 was overexpressed in D492MmiR-200c-141 the full progenitor cell phenotype of D492 was restored, meaning that these cells could generate both luminal and myoepithelial cells and form TDLU-like structures in 3D-rBM culture. The main paper in my thesis focused on miRNA-203a, its expression during branching and EMT, and the identification of potential novel targets of miR-203a. In this paper, I repeated the miRNA expression analysis, which was done between D492 and D492M, and instead of using microarrays, I used next generation sequencing (NGS). I focused on differences in gene expression from 3D-rBM cultures at different stages of branching (D492) and also compared to the mesenchymal phenotype generated by D492M. The expression patterns from NGS were surprisingly similar to previous analysis done on monolayer cultures using microarrays. It was interesting to see that miR-203a showed a gradual increase in expression accompanied by increased complexity of the branching structures. MiR-203a was not detected in D492M and when it was overexpressed in D492M, cells partially changed phenotype towards the epithelial phenotype, but not as prominently as was previously seen in D492MmiR-200c-141. D492MmiR-203a cells showed reduced cell proliferation, less ability to form colonies in low attachment cultures, less ability to migrate and reduced invasion capability. Gene expression analysis of D492M and D492MmiR-203a revealed peroxidasin (PXDN), a collagen IV cross-linking agent, as a novel target of miR-203a. We confirmed the binding of miR-203a to the 3’-UTR of PXDN using Luciferase assay. In the final paper, I participated in work that demonstrated differential sensitivity of D492 and D492M cells to inhibition of the protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). We showed that inhibition of PTP1B disrupted cell-cell adhesion and induced anoikis in D492 cells. Interestingly, D492M cells were more sensitive to PTP1B inhibition than D492 and in addition overexpression of miR-200c-141 in D492M made the cells more resistant to PTP1B inhibition. We hypothesized that PTP1B inhibition could potentially be used in cancer therapy involving the EMT phenotype. Collectively, in my thesis I used isogenic breast epithelial cell lines with epithelial and mesenchymal phenotypes to explore the expression and functional roles of miRNAs in branching morphogenesis and EMT. I have elucidated the role of miR-200c-141 and miR-203a in these processes and identified PXDN as a novel target of miR-203a. In addition, it was shown that PTP1B inhibition disrupts cell–cell adhesion and induces anoikis in breast epithelial cells.