Ionic effects on subunit interactions in a cold-active alkaline phosphatase from the marine bacterium Vibrio splendidus

Abstract

Protein quaternary structures are fundament for life. Proteins have evolved towards large assemblies of subunits needed for the execution of complex chemistry, for building structural components or for compartmentalization. Most oligomeric enzymes exist as homodimers, having two subunits with identical active sites. It is largely unknown why enzymes have evolved in so many cases towards the homodimer structure (and larger oligomeric structures). Alkaline phosphatase (AP) is an excellent model enzyme for the large family of homodimeric hydrolases. Its activity is dependent on dimerization and correct metal occupancy of the three metal ions in the active site. The reason why the enzyme does not function in the monomeric form is still unknown. The focus of this Ph.D. work was on the AP ortholog from Vibrio splendidus (VAP), a cold-adapted marine bacterium. This enzyme is thermally unstable above room-temperature, but also one of the most active variants of its kind at low temperatures. These characteristics are very dependent on the solution conditions. Stability is only maintained at high ionic strength and pH. Here, the focus was on studying the importance of the dimeric structural state for the function, in particular the role of the metal ions for catalysis. The results suggested that the enzyme inactivates irreversibly to a dimeric intermediate state. This dimeric intermediate state was shown to be more dynamic than the native state, defined as measurable changes in the range of conformations of the ensemble of enzyme molecules, yet fully metalated. Furthermore, the enzyme lost its putative half-of-sites reactivity which is dependent on subunit interactions and communication between active sites. The effect of ionic strength on the activity and stability was studied and found to be positive for both features. It is proposed that a deprotonation step causes a conformational change in VAP, based on pH specific effects on physical parameters. Furthermore, the large interface loop, which characterizes VAP, was shown to be mostly important for stability but also needed for local structural rigidity close to the catalytically active residues. This thesis promotes the idea that the role of the homodimeric state is to provide a conformational energy for both stabilization and catalysis of the enzyme, through the interface, not available in the monomeric state.

Fjórða stigs bygging próteina er grunnur alls lífs á jörðinni eins og við þekkjum það. Prótein hafa þróast í átt að stórum komplexum til að hvata flókin efnahvörf, til margvíslegra byggingahlutverka, eða hólfunar. Flest ensím eru virk sem einþátta tvíliður með tvær eins hvarfstöðvar. Hvers vegna svo mörg ensím finnast sem einþátta tvíliður er ekki vel rannsakað. Alkalískur fosfatasi (AP) er módel ensím fyrir hýdrólasa sem eru einþátta tvíliður. Virkni AP er háð tvíliðumyndun og málmjónum í hvarfstöð. Hvers vegna hvarfstöðvarnar hafa ekki hvarfgetu í einliðuforminu er ekki vitað. Rannsóknarefni þessarar doktorsritgerðar var AP úr Vibrio splendidus (VAP) kaldsjávarbakteríu. VAP er eitt hitaóstöðugasta ensím sem þekkist en einnig eitt það virkasta við lág hitastig miðað við sambærileg ensím. Áhersla var lögð á að skýra hlutverk tvíliðumyndunar hjá VAP og áhrif jóna á hvötun og stöðugleika, en einnig að útskýra hvers vegna AP hafa ekki virkar einliður. Þessir þættir eru mjög háðir lausnaaðstæðum. Niðurstöður bentu til þess að við afvirkjun ensímsins verði óafturkræf myndbreyting sem leiðir til óvirkrar tvíliðu. Óvirka tvíliðan var lausbundnari, innihélt allar þrjár málmjónirnar í hvarfstöð en hafði mögulega misst eiginleikann til þess að hvata með svokölluðum “half-of-sites” hvarfgangi. Áhrif jónastyrks voru mikil á virkni og stöðugleika og voru áhrifin háð pH, þar sem afprótónering óþekkts sýruhóp veldur myndbreytingu. Að auki var kannað hlutverk löngu yfirborðlykkjunnar sem einkennir VAP frá flestum AP. Meginhlutverk lykkjunna er að stuðla að stöðugleika hvarfstöðvar en einnig í að halda ákveðinni stífni í lykkjum nálægt virkum hliðarkeðjum. Niðurstaða vinnu þessarar ritgerðar bendir til þess að meginhlutverk tvíliðunnar sé það tillegg byggingarfríorku sem verður til á snertiflötum einliðanna sem stuðlar bæði að stöðugleika og hvötun, sem ekki eru til staðar í einliðunum.