Mechanistic insights into the role of KMT2D in Kabuki syndrome 1

Abstract

Kabuki syndrome type 1 (KS1) is a Mendelian disorder of the epigenetic machinery (MDEM) caused by heterozygous pathogenic variants in the histone methyltransferase 2 D (KMT2D). KS is a multi-organ disorder with variable phenotypic presentations among different individuals. Among the most common features seen are distinctive facial characteristics, intellectual disability and growth deficiency. Beyond its established role in histone methylation, KMT2D has been suggested to play a role in additional cellular functions such as differentiation of various cell lines. The aims of this thesis were to get a better understanding of how KMT2D plays a role in KS disease phenotypes. To achieve this, we used three approaches. First, we generated a novel KS mouse model with the patient specific missense variant R5230H corresponding to R5179H in humans. This variant is located within the FYR-N domain, a domain that has been found enriched for KS specific missense variants. The patient harboring this variant had classical features of KS indicating that this is a disease-causing variant. To predict consequences of the R5230H substitution on protein structure we used AlphaFold3. The prediction did not suggest structural changes of the protein with this amino acid substitution. However, we observed changes in surface charge which might affect ability to interact with other proteins. A Western blot showed that the substitution does not alter KMT2D protein stability nor global H3K4 methylation. Our mouse model displays core KS features described in a previous loss-of-function mouse model with the exception of the defects in adult neurogenesis. Additionally, the model displayed a novel phenotype of unilateral renal agenesis. To investigate the function of KMT2D specifically in bone development, we utilized a previously published chondrocyte model with KMT2D deficiency (Kmt2d-/-) that is known to display precocious differentiation. We found that these cells exhibit decreased cell cycling and proliferation capacity. Pathway enrichment analysis of differentially expressed genes revealed upregulation of factors participating in hypoxic response and glycolysis. Consistently, we observed upregulation of Hif1a expression and increased lactate secretion throughout differentiation. To determine whether dysregulation of these pathways contributes to premature hypertrophy, we knocked down Hif1a in Kmt2d-/- cells during differentiation to inhibit the hypoxia response, but did not observe any changes in the differentiation rate. Additionally, we induced hypoxia signaling in Kmt2d+/+ cells by lowering the oxygen levels during differentiation, thereby promoting anaerobic glycolysis. However, this did not accelerate differentiation, suggesting that neither hypoxia nor glycolysis is the primary driver of the observed precocious differentiation. To examine the underlying cause of pathway dysregulation in Kmt2d-/- cells, we performed a Seahorse Mito Stress test to assess mitochondrial function. We observed reduced mitochondrial respiration in Kmt2d-/- cells compared with Kmt2d+/+ cells, accompanied by increased superoxide (•O2-) production. Under low energy requirements, hydrogen peroxide (H2O2) accumulation was neutralized through an upregulation of the antioxidant response via Nfe2l2. However, with increasing energy demand during differentiation, Kmt2d-/- cells showed a nine-fold increase in H2O2 accumulation compared with Kmt2d+/+ cells. By limiting oxygen availability or targeting mitochondrial reactive oxygen species (ROS) with drugs, we successfully reduced ROS levels, rescuing early senescence and preventing terminal hypertrophy. To elucidate the role of KMT2D in defective chondrocyte differentiation, we performed CUT&RUN for H3K4me1, H3K4me3 and KMT2D. Our analysis revealed that KMT2D was primarily located at promoter regions and consistently, we observed the most significant effect on H3K4me3. Previous research in the same chondrocyte model reported a bidirectional transcriptional effect following KMT2D loss. Cross-examination of these datasets showed that the transcriptional changes were largely associated with H3K4me3 but not H3K4me1 alterations. Motif analysis of KMT2D genomic binding suggested that KMT2D co-localizes with multiple transcription factors involved in chondrocyte differentiation and metabolism. Notably, one of the enriched transcription factors was E2F4, a known cell cycle repressor and a potential regulator of mitochondrial metabolism. Furthermore, mass spectrometry suggests a direct interaction between KMT2D and E2F4, which was absent in Kmt2d-/- cells. Finally, among the KMT2D target genes, four: Mpc2, Aco1, Acly and Mdh1, are known to be directly involved in mitochondrial metabolism. Collectively, our findings highlight the complexity of KMT2D function in organ development, which appears to be both cell type- and stage-specific. We established a novel mouse model that serves as a valuable tool for studying KS disease progression and potential therapeutic strategies. Lastly, our results provide compelling evidence that in chondrocytes, KMT2D plays a critical role in differentiation through its regulation of mitochondrial metabolism.

Kabuki heilkenni týpa 1 (KS1) er Mendelskur erfðasjúkdómur í umframerfðakerfinu sem orsakast af arfblendnum stökkbreytingum í geni sem táknar fyrir histón-metýltransferasa 2D (KMT2D). Birtingarmynd KS er breytileg milli einstaklinga en meðal algengustu einkenna eru sérstæðir andlitsdrættir, þroskaskerðing og vaxtarskerðing. Þó svo að KMT2D hafi þekkt hlutverk í histón-metýleringu, hefur verið lagt til að það gegni einnig mikilvægum hlutverkum í annarri frumustarfsemi eins og sérhæfingu ýmissa frumutegunda. Markmið þessarar doktorsritgerðar er að auka skilning á hlutverki KMT2D og áhrifum þess á sjúkdómsmynd KS. Til að ná þessu markmiði beittum við þremur nálgunum. Fyrst þróuðum við nýtt músalíkan fyrir KS með sjúklingasértæku mislestursbreytingunni R5230H sem samsvarar R5179H í mönnum. Þessi breyting er innan FYR-N hneppis þar sem KS sértækar breytingar finnast í auknum mæli. Einstaklingurinn með þessa tiltæku breytingu sýndi klassísk einkenni KS sem bendir til þess að þetta sé sjúkdómsvaldandi stökkbreyting. Til að spá fyrir um áhrif R5230H á prótínbyggingu notuðum við spálíkanið AlphaFold3. Spálíkanið sýndi engar byggingarbreytingar af völdum amínósýruskiptanna, en leiddi hins vegar í ljós breytingar í rafhleðslu á þessu sama svæði sem gæti haft áhrif á prótín-prótín samskipti. Prótín litun leiddi í ljós að breytingin hafði hvorki áhrif á stöðugleika KMT2D-prótínsins né á almenna H3K4-metýleringu. Músalíkanið okkar sýndi helstu einkenni KS sem áður höfðu sést í músalíkani með tapi á KMT2D virkni fyrir utan truflun á nýmyndun taugafruma á fullorðinsskeiði. Þar að auki sýndi líkanið nýja svipgerð þar sem í mörgum KS dýranna myndaðist aðeins eitt nýra. Til að rannsaka hlutverk KMT2D sérstaklega í eðlilegum beinþroska notuðum við áður birt brjóskfrumulíkan með tap á KMT2D (Kmt2d-/-) en þessar frumur sýna ótímabæra sérhæfingu miðað við Kmt2d+/+ frumur. Við komumst að því að þessar frumur fara síður í gegnum frumuhringinn og hafa þar að leiðandi minnkaða getu til frumufjölgunar. Greining á boðferlum hjá mistjáðum genum sýndi aukningu í virkjun boðferla tengdum súrefnisskorti og aukningu á þáttum sem tengjast glýkólýsu. Það samræmdist aukinni tjáningu á Hif1a og seytingu á laktati í gegnum sérhæfingarferlið. Til að kanna hvort truflun í þessum boðferlum sé orsök fyrir ótímabærri sérhæfingu, bældum við Hif1a í Kmt2d-/- frumum til að draga úr ofvirkjun á svari við súrefnisskorti. Það hafði hins vegar engin áhrif á sérhæfingarhæfni frumnanna. Einnig virkjuðum við svar við súrefnisskorti í Kmt2d+/+ frumum með því að lækka súrefnisstyrk í ræktunarskáp og ýta þannig undir aukna notkun á glýkólýsu. Það hraðaði hins vegar ekki sérhæfingu, sem bendir til þess að hvorki Hif1a né glýkólýsa séu aðalhvatarnir í ótímabærri sérhæfingu. Til að rannsaka undirliggjandi orsakir truflunar á þessum boðferlum í Kmt2d-/- frumum framkvæmdum við streitupróf fyrir hvatbera (e. Seahorse assay) til að meta hvatberavirkni. Við sáum minnkaða hvatberaöndun í Kmt2d-/- frumum miðað við Kmt2d+/+ frumur ásamt aukinni framleiðslu á súperoxíði (•O2−). Við lága orkuþörf var dregið úr áhrifum á uppsöfnun vetnisperoxíðs (H2O2) með virkjun andoxunarviðbragða í gegnum aukna tjáningu á Nfe2l2. Hins vegar, þegar orkuþörf jókst í sérhæfingarferlinu, sýndu Kmt2d-/- frumur níföldun í uppsöfnuðu H2O2 miðað við Kmt2d+/+ frumur. Með því að minnka súrefnisstyrk eða hindra oxunarálag (ROS) frá hvatberum með lyfjum gátum við dregið úr ROS myndun og komið í veg fyrir ótímabæra þroskun brjóskfrumna. Til að skýra hlutverk KMT2D í gallaðri sérhæfingu brjóskfruma framkvæmdum við greiningu á CUT&RUN gögnum þar sem H3K4me1, H3K4me3 og KMT2D merki voru greind. Greiningin sýndi að KMT2D var að mestu staðsett við stýrilsvæði gena og hafði mest áhrif á H3K4me3. Fyrri rannsóknir á sama brjóskfrumulíkani sýndu að tap á KMT2D leiddi bæði til virkjunar og bælingar á umritun gena. Með því að bera saman þessi gagnasett, sáum við að breytingar í umritun tengdust að mestu H3K4me3, en ekki H3K4me1. Mynsturgreining á umritunarþáttum á KMT2D bindisvæðum benti til þess að KMT2D vinni með fjölmörgum umritunarþáttum sem tengjast bæði brjóskfrumusérhæfingu og efnaskiptum. Einn af áhugaverðustu umritunarþáttunum var E2F4, sem er með þekkt hlutverk í bælingu frumuhringsins og mögulegur þáttakandi í stjórnun hvatberastarfsemi. Þar að auki sýndi massagreining á próteinmagni bein tengsl milli KMT2D og E2F4, sem voru ekki til staðar í Kmt2d-/- frumum. Að lokum kom í ljós að meðal bindiseta KMT2D, voru fjögur bendluð við genin: Mpc2, Aco1, Acly og Mdh1, sem voru minna tjáð í Kmt2d-/- frumum heldur en Kmt2d+/+ frumum, og beintengd hvatberaefnaskiptum. Niðurstöður okkar undirstrika margvíslega virkni KMT2D í líffæraþroskun, þar sem hlutverk þess virðist vera bæði frumugerðarsértækt og háð þroska- og sérhæfingarstigi. Við þróuðum nýtt músalíkan sem getur verið gagnlegt tól til að rannsaka framgang KS og mögulegar meðferðarleiðir. Að lokum sýna niðurstöður okkar að í brjóskfrumum gegnir KMT2D lykilhlutverki í sérhæfingu með því að stjórna hvatberaefnaskiptum.