Autophagy is a cellular degradation process, important for maintaining cellular homeostasis. It has been shown to be involved in cancer initiation and development, either in a tumour-suppressive or promotive manner. The protein ATG7 is known to be essential for autophagy initiation by catalysing the lipidation of ATG8 proteins. Previously, we identified a short isoform, termed ATG7(2), which lacks 27 amino acids in the active domain of the protein, compared with the full-length ATG7(1), and is unable to lipidate ATG8 proteins.
ATG7 is known to play a role in cancer progression and metastasis, and this role has long been associated with autophagy. However, recent studies suggest that this role could be, in part, autophagy-independent. Additionally, ATG7 has been shown to regulate YAP translocation to the nucleus, which is associated with poor prognosis in pancreatic adenocarcinoma (PAAD). Indeed, YAP is active in the nucleus, where it binds with a transcription factor, TEAD, to regulate the expression of genes involved in proliferation, migration, and immune regulation. Its activity is negatively regulated by the Hippo pathway, which is often dysregulated in cancer.
To understand the role of ATG7(2), we analysed clinical data from publicly available databases. First, we analysed the correlation between ATG7(1) or ATG7(2) expression with survival across cancers. This showed that high ATG7(2) expression is linked with poor prognosis in PAAD. Then, we quantified the mRNA expression of ATG7(1) and ATG7(2) in healthy versus cancerous pancreatic samples and observed an increase in the expression of both isoforms in the tumour samples. When analysing this in PAAD clinical stages, we observed increased ATG7(2) expression in Stage IV compared with other stages. Finally, our analysis revealed that immuno-active tumours express higher levels of ATG7(2) than immunologically quiet ones, across cancers.
Using CRISPR/Cas9 in a PAAD cell line, we selectively knocked out the canonical isoform ATG7(1) or total ATG7. We performed proliferation and migration assays on clones expressing different levels of endogenous ATG7(2). While total knock-out of ATG7 was linked with slow migration, ATG7(1)-/- showed faster proliferation and migration, especially with high levels of ATG7(2). To further explore the effect of ATG7(2) on PAAD, we performed cell fractionation to study the nuclear translocation of YAP in the different CRISPR cell lines. ATG7(1)-/- cells exhibited accumulation of YAP in both the cytoplasm and nucleus, while total ATG7 knock-out cells showed limited accumulation of YAP, and decreased nuclear translocation compared with the control cells. Together, these results suggest that ATG7(2) could regulate YAP activity in PAAD cells and drive migration and proliferation in an autophagy-independent manner.
Finally, we used siRNA to specifically knock down ATG7(2) in control and ATG7(1)-/- cells. This led to decreased migration and proliferation rates in both cell types, as well as decreased YAP nuclear translocation and transcriptional activity in ATG7(1)-/- cells compared with control siRNA. This project highlights the importance of ATG7(2) in cancer, as well as its potential interest as a therapeutic target.
Sjálfsát er niðurbrotsferli frumna og er mikilvægt til að viðhalda frumujafnvægi. Sýnt hefur verið fram á að það tekur þátt í myndun og þróun krabbameins, annað hvort á æxlisbælandi eða -örvandi hátt. ATG7 er nauðsynlegt fyrir upphaf sjálfsáts með því að tengja ATG8 prótein við lípíð. Við höfum greint stutt ísóform, kallað ATG7(2), sem skortir 27 amínósýrur í virka svæði próteinsins samanborið við fullu lengd próteinsins, ATG7(1). ATG7(2) getur ekki bundið ATG8 prótein við himnur og skortir því skilgreinda virkni ATG7.
Vitað er að ATG7 gegnir hlutverki í framvindu krabbameins og meinvörpum, og það hlutverk hefur lengi verið tengt sjálfsáti. Hins vegar benda nýlegar rannsóknir til þess að þetta hlutverk gæti að hluta til verið óháð sjálfsáti. Að auki hefur verið sýnt fram á að ATG7 stjórnar YAP flutningi í kjarna, sem tengist slæmum horfum í briskrabbamein (PAAD). YAP er prótein sem er virkt í kjarnanum þar sem það binst umritunarþætti, TEAD, til að stjórna tjáningu gena sem taka þátt í fjölgun, frumuskriði og ónæmisstjórnun. Virkni þess er bælt af Hippo ferlinu, sem er oft trufluð í krabbameini.
Til að skilja hlutverk ATG7(2) greindum við klínísk gögn úr opnum gagnagrunnum. Í fyrsta lagi greindum við fylgni milli tjáningar ATG7(1) eða ATG7(2) og lifun í krabbameinum. Þetta sýndi að há ATG7(2) tjáning tengist slæmum horfum í PAAD. Síðan mældum við mRNA tjáningu ATG7(1) og ATG7(2) í heilbrigðum sýnum borið saman við briskrabbamein og sáum aukningu í tjáningu beggja ísóforma í æxlissýnunum. Þegar þetta var greint á klínískum stigum PAAD sáum við aukna tjáningu ATG7(2) á stigi IV samanborið við önnur stig. Að lokum leiddi greining okkar í ljós að ónæmisvirk æxli tjá hærra magn af ATG7(2) en ónæmisóvirk æxli, í öllum krabbameinum.
Með því að nota CRISPR/Cas9 í PAAD frumulínu slógum við út meginísóformið ATG7(1) eða heildar ATG7. Við gerðum fjölgunar- og frumuskriðspróf á klónum sem tjáðu mismunandi magn af ATG7(2). Þó að heildarútsláttur ATG7 hafi verið tengdur hægu frumuskriði, sýndi ATG7(1)-/- hraðari útbreiðslu og skrið, sérstaklega með háu magni ATG7(2). Til að kanna frekar áhrif ATG7(2) á PAAD, greindum við flutning YAP til kjarna í mismunandi CRISPR frumulínum. ATG7(1)-/- frumur sýndu uppsöfnun YAP bæði í umfrymi og kjarna, en heildar ATG7 útsláttarfrumur sýndu takmarkaða uppsöfnun YAP og minni kjarnaflutning miðað við samanburðarfrumurnar. Saman benda þessar niðurstöður til þess að ATG7(2) gæti stjórnað YAP virkni í PAAD frumum og þannig knúið áfram skrið og fjölgun á sjálfsátsóháðan hátt.
Að lokum notuðum við siRNA til að slá sérstaklega niður ATG7(2) í samanburðar- og ATG7(1)-/- frumum. Þetta leiddi til minni skrið- og fjölgunarhraða í báðum frumugerðum, auk minni flutnings YAP til kjarna og umritunarvirkni í ATG7(1)-/- frumum miðað við samanburðar-siRNA. Þetta verkefni varpar ljósi á mikilvægi ATG7(2) í briskrabbameini, sem og hugsanlega nýja meðferðarmöguleika.
Læst til 01.01.2029