Expired human platelets for mesenchymal stromal cell propagation

Abstract

Mesenchymal stromal cells (MSC) are promising candidates for cellular therapy due to their ability to regenerate bone and cartilage and modulate immune responses. The use of MSC in cellular therapy is problematic due to the need for fetal bovine serum (FBS) during ex vivo expansion of the cells. The use of FBS may lead to detrimental side effects for patients such as cross-species viral infections and severe immune responses. Alternative cell culture supplements are therefore needed. Lysates derived from platelets have been suggested, mainly due to the abundance of various growth factors and cytokines that are found in platelet granules. Platelets to make lysates can be obtained from blood banks. Blood banks, however, do not possess a large surplus of platelets since they face a shortage of platelet donors. Still, a significant number of platelet concentrates expire annually in blood banks and are discarded. These expired platelets could be used as an alternative to FBS to make lysates in an economical and effective way. Furthermore, the resources of blood banks would be utilized in a more efficient manner. Human embryonic-derived mesenchymal progenitor (hES-MP) cells have been envisioned as a future source of MSC which, for the same reason as MSC, also require serum-free culture supplements. In this thesis, we evaluated the suitability of expired platelets and expired pathogen-inactivated platelets to support the growth, phenotype, immune function, and tissue formation of MSC and hES-MP cells. Platelet lysates from expired platelets supported MSC and hES-MP growth, phenotype, and tissue formation to an equal or greater extent than lysates from fresh platelets or FBS. Platelet lysates supported osteogenic differentiation particularly well, causing upregulation of alkaline phosphatase activity, tissue mineralization, and osteogenic gene expression. Similar observations were obtained for platelet lysates from expired pathogen-inactivated platelets which supported MSC in all aspects evaluated. Furthermore, adding platelet lysates from expired pathogen-inactivated platelets to the tissue differentiation media enhanced both osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC and hES-MP compared to FBS. In both platelet lysate and FBS, hES-MP cells proliferated faster than MSC and reached higher cell numbers in shorter time. However, hES-MP failed to suppress immune cell proliferation, while MSC did so effectively. Both cell types, nevertheless, differentiated successfully toward osteogenic, chondrogenic, and adipogenic lineages independent of the culture supplement used. We conclude that lysates from expired platelets, pathogen-inactivated or not, successfully support the expansion of MSC and hES-MP while also allowing the cells to maintain their capacity to modulate immune responses and differentiate. Expired platelets therefore represent a feasible and attractive source material to make platelet lysates for FBS replacement.

Mesenkímal stofnfrumur úr beinmerg (MSC) lofa góðu fyrir notkun í vefjalækningum sökum hæfni þeirra til að mynda vefi stoðkerfisins og til að stýra ónæmissvari. Notkun þeirra eru þó vandasöm vegna þess að kálfasermi þarf til að rækta þær utan líkamans. Kálfasermi er óæskilegt því það getur haft skaðleg áhrif í för með sér, svo sem hættu á dýrbornusmiti og ónæmis- og bólgusvari í frumuþega. Nauðsynlegt er að finna aðra lausn sem er ekki upprunnin úr dýrum, leysir kálfasermi af hólmi og styður við MSC frumur í rækt. Blóðflögulausnir úr blóðflögum manna hafa verið ræddar í þessu samhengi sökum þess hve ríkar þær eru af vaxtarþáttum og frumuboðum sem finnast í seytiögnum þeirra. Blóðflögur sem má breyta í blóðflögulausnir fást hjá blóðbönkum. Blóðbankar eiga hinsvegar ekki umframmagn af blóðflögum til að láta af hendi þar sem þeir búa nú þegar við skort á blóðgjöfum. Engu að síður þarf að farga töluverðu magni af blóðflögum árlega vegna þess að þær renna út. Útrunnar blóðflögur væri hægt að nota til að útbúa ræktunarlausnir á hagkvæman, ódýran og skilvirkan hátt sem staðgengil kálfasermis fyrir frumuræktir. MSC frumur sérhæfðar frá stofnfrumum úr fósturvísum (hES-MP) hafa líka verið skoðaðar sem möguleiki fyrir vefjalækningar og því einnig mikilvægt að finna ræktunarlausnir fyrir þær sem eru ekki upprunar frá dýrum. Í þessari rannsókn skoðuðum við hæfni útrunnina blóðflagna og útrunnina smithreinsaðra blóðflagna frá Blóðbankanum til að styðja við MSC og hES-MP frumur í rækt. Frumuvöxtur, tjáning á yfirborðssameindum, þátttaka í ónæmissvari og hæfni þeirra til að mynda vefi stoðkerfisins var skoðuð sérstaklega. Blóðflögulausnir úr útrunnum blóðflögum voru jafngildar eða betri en kálfasermi og blóðflögulausnir úr ferskum blóðflögum þegar frumuvöxtur, tjáning á yfirborðssameindum og vefjamyndun var skoðuð hjá MSC og hES-MP frumum. Blóðflögulausnir hentuðu sérstaklega vel til að styðja við beinmyndun sem sást með aukinni virkni alkalísks fosfatasa, útfellingu steinefna í vef og aukinni genatjáningu fyrir beinmyndun. Sambærilegar niðurstöður komu fram við notkun á blóðflögulausnum úr útrunnum smithreinsuðum blóðflögum. Þegar slíkum blóðflögulausnum var bætt út í æti fyrir vefjasérhæfingu kom fram aukin bein- og brjóskmyndun umfram það sem sást við notkun á kálfasermi. hES-MP frumur, bæði í blóðflögulausnum og kálfasermi, fjölguðu sér hraðar heldur en MSC frumur. hES-MP frumur gátu hinsvegar ekki dregið úr fjölgun ónæmisfruma líkt og MSC frumur gera. Báðar frumutegundir mynduðu þó bein, brjósk og fituvef. Blóðflögulausnir úr útrunnum blóðflögum, smithreinsuðum eður ei, henta sem ræktunarlausnir fyrir MSC og hES-MP frumur án þess að draga úr hæfni þeirra til frumufjölgunar, þátttöku í ónæmissvari eða vefjamyndun. Útrunnar blóðflögur eru því ákjósanlegur efniviður fyrir blóðflögulausnir sem nota má í stað kálfasermis.