Introduction and aims: Development of the nervous system is a complex and highly regulated process that, when impaired, can result in a multitude of disorders of varying behavioural, cognitive, and functional severity. Variation in brain structure and function is considered causal in neurodevelopmental and psychiatric disorders. However, these disorders are not, nosologically, defined by evident, or at least consistently replicated, neuropathology, and the underlying biological mechanisms are largely unknown. Autism spectrum disorder (ASD), intellectual disability (ID), learning disorders and attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) are increasingly prevalent, childhood onset disorders with diverse phenotypic presentation and etiology. These disorders co-occur frequently, with research in recent years revealing evidence for shared risk factors and genetic studies providing novel insights into the pathogenesis and biochemical pathways perturbed in these disorders.
Four studies form the basis of the work described in this thesis where novel associations with neurodevelopmental disorders (NDDs) are described as well as how the sequence variants impact cognition and brain structure and function. The aim of the research was to increase understanding of the etiology of NDDs, improve detection and diagnosis that might bolster treatment and support personalised medicine. This is of particular interest for the NDDs due to their early onset and heterogeneous nature but more significantly the importance to intervene with treatments as early as possible to improve treatment success and quality of life.
Methods: Single nucleotide polymorphism (SNP) chip array genotyping, followed by data analysis with the PENN-CNV algorithm, allowed identification of individuals carrying copy number variations, that have previously been associated with ASD and schizophrenia. Inidividual carriers, without a diagnosis of ASD or schizophrenia were offered participation. For the final study (paper IV) whole genome sequencing (WGS) was applied and all coding variants identified for analysis.
Firstly, a battery of tests gauging various cognitive domains, previously observed to be impaired in schizophrenia or ASD, were applied. These include attention, spatial working memory, logical memory, executive function, cognitive flexibility, language, processing speed and emotion recognition. The intelligence quotient, was also estimated, using Wechslers scale of intelligence and subjects asked about learning difficulties (reading and mathematics), daily functioning and a short psychiatric evaluation was performed. Statistical analyses used a generalised least-squares regression with a variance-covariance matrix based on the kinship coefficient of each pair of individuals and multiple comparisons were accounted for using a Bonferroni correction to set appropriate P-value threshold.
Second, magnetic resonance imaging (MRI) was used to collect structural images of the brain subsequently segmented into white matter (WM), grey matter (GM) and cerebrospinal fluid using standard methods (Statistical Parametric Mapping, SPM8 software) to examine voxel-based morphometry (VBM), in the Matlab platform, by analysing regional brain volumes (in regions of interest; ROI) on a voxel-by-voxel basis with a multiple regression model. Brain-wide surface-based morphometry (SBM) of the image data was also performed with FreeSurfer which segments and parcellates regions according to predefined atlases into volumes, surface areas and thickness values and generalised least-squares regression used to analyse the date.
Third, functional MRI data were also collected from a subset of the structural MRI sample. The functional MRI consisted of two paradigms, a phonological lexical decision task, based on published methods, and a multiplication verification task. Broadly, in the word task participants were asked to decide whether a visually presented letter string sounded like a real word or not and for the multiplication task participants were asked to verify whether a visually presented multiplication equation was correct or not. The functional MRI data was handled with validated methods and statistically analysed using SPM12. Based on results from the structural MRI and a prior hypothesis, a mask was generated which focuses the analysis on specific regions.
Fourth, diffusion tensor image data were also acquired and pre-processed using the Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain Software Library. Using tract-based spatial statistics (TBSS) voxel-wise statistical analysis of the fractional anisotropy (FA) data was performed. Multiple regression models were used to investigate the effect of carrier status on FA.
Results: Paper I. CNVs repesent an important part of the sequence diversity of the human genome and CNVs in many regions have been identified as harbouring risk factors for NDDs and psychiatric disorders. From the literature 26 CNVs were identified, referred to as neuropsych CNV alleles, that have been associated with schizophrenia and/or ASD, and carriers of these alleles offered participation in a study that gauges cognitive ability on a range of aptitude tests. Results revealed that carrying one of these CNVs incurs a disadvantage in the form of cognitive impairment; with the 16p11.2 proximal deletion, 17p12 deletion and 16p13.11 duplication showing the strongest overall association with verbal and/or performance IQ impairment. While the 15q11.2(BP1-BP2) deletion shows modest impairments on the neuropsychological tests it is strongly associated with a history of difficulties in learning to read (dyslexia) and mathematics (dyscalculia), even after accountig for IQ. Participants in the study also had scans of their brain applying structural MRI in search of neural intermediate phenotypes. As a consequence of these results and the previously identified association with schizophrenia, the 15q11.2(BP1-BP2) CNV carriers were examined with MRI and, based on ROI analyses of the MRI data defined by a recent meta-analysis of first-episode psychosis, it was found that the deletion carriers have a reduced volume of GM in the perigenual anterior cingulate cortex and the left insula. Furthermore, deletion carriers showed reductions in WM of the temporal lobe, bilaterally, and an increase in the volume of the corpus callosum (CC). 15q11.2(BP1-BP2) duplication carriers showed reciprocal changes in the same regions altered in deletion carriers for both GM and WM. Most of the CNVs tested showed lower fecundity, strongest effect shown by 16p11.2 proximal deletion and 22q11.21 duplication, especially in males. This supports the observation that many of these recurrent sequence variants are under negative selection.
Paper II. A larger, hypothesis free, follow-up study showed that the 15q11.2(BP1-BP2) deletion associates with an increased WM volume of the anterior CC and decreased GM in left fusiform gyrus and left angular gyrus. Using tailored functional MRI paradigms, phonological lexical decision and multiplication verification tasks, decreased activation in the left fusiform and the left angular gyri were observed in deletion carriers. While brain regions showed reciprocal (mirrored) changes between 15q11.2(BP1-BP2) deletion and duplication carriers, cognitive abilities did not. Furthermore, variations in cognitive test scores and brain imaging phenotypes did not significantly correlate, most likely due to a decrease in power to detect such an effect from modest overlap of cognitive assessment and MRI.
Paper III. Of the 26 CNVs discussed in paper I, 19 were considered to fulfill the claim of significant association with ASD or schizophrenia. Fourteen had power to be tested for association, and eight exhibited significant association with ADHD. Association with two CNVs has been reported previously, 16p13.11 duplication and 22q11.21 deletion, but associations with the remaining six are novel, deletions at 2p16.3 (NRXN1), 15q11.2, 15q13.3 (BP4 & BP4.5-BP5), and duplications at 1q21.1 distal, 16p11.2 proximal, and 22q11.21, although an increased frequency of ADHD in carriers has been reported for some. As a group, the 19 CNVs associate significantly with ADHD, even when co-occurring ASD and schizophrenia were excluded from the sample.
Paper IV. Applying family-based analysis to WGS data, testing rare coding-sequence variants for segregation with ID and lowered IQ, uncovered three loss of function (LoF) variants in the microtubule-associated protein 1B (MAP1B) gene in three separate Icelandic pedigrees. Structural MRI, of MAP1B LoF carrier brains, revealed significantly lower brain wide WM volume with considerable deficit in the CC. TBSS analysis applied to whole-brain diffusion data revealed an association with reduced FA in brain-wide WM tracts in MAP1B LoF carriers. Clinical assessment of the MRI also showed periventricular nodular heterotopia in nine of the ten MAP1B LoF carriers. Functional studies, where plasmids expressing MAP1B protein that has incorporated each of the LoF mutations, showed that truncated MAP1B protein is stable.
Conclusions: NDDs and psychiatric disorders can be debilitating conditions for those affected. Changes in cognition are an integral part of these disorders and intellectual impairment a confounding factor in their presentation. To study the cognitive element, independent of the clinical state, we identified carriers of sequence variants, that confer risk of NDDs and psychiatric disorders, yet do not have a diagnosis of those disorders. These individuals were administered a battery of cognitive tests and brain MRI that establish specific cognitive impairments and structural changes akin to those diagnosed with schizophrenia. This led us to propose that the cognitive impairments are not necessarily consequences of the disorders they accompany but may in fact mediate some of the disorder risk instead. Using those same tools, we identified an association between a CNV and specific learning disorders, independent of IQ, and structural and functional changes in the brain previously identified as being important for reading and arithmetic. We also discovered protein truncating variants that associate strongly with intellectual impairments and dramatic changes in brain WM. The results we present broadening the impact of the Neuropsych CNVs to include risk of ADHD, highlights the pleiotropic effects of these CNVs but also adds to the evidence that the NDDs and psychiatric disorders are related rather than etiologically distinct entities. The examples above demonstrate the advantage of applying genetics to tease apart confounding traits and provides an avenue for studying the connection between neurological changes and cognition.
Inngangur og markmið: Þroskunarferli taugakerfisins er flókið kerfi, undir nákvæmri
stjórn, og truflanir geta leitt til mismunandi raskana á hegðun eða vitrænni
starfsemi. Talið er að orsakasamhengi sé á milli breytinga í byggingu heilans og
virkni hans, sem og taugaþroska- og geðraskana. Þó eru raskanir ekki skilgreindar á
grundvelli slíkra breytinga og undirliggjandi líffræðilegir þættir og ferli eru að mestu
leyti óþekkt. Röskun á einhverfurófi, skert greind, námsraskanir, og
athyglisbrestur/ofvirkniröskun eru sífellt algengari raskanir, sem oft fylgjast að og
verður yfirleitt vart við í æsku. Rannsóknir undanfarinna ára benda til sameiginlegra
erfðafræðilegra áhættuþátta. Í erfðamenginu er hægt að greina kirnabreytileika
með raðgreiningu og suma eintakabreytileika með örflöguskimun, og breytileikar í
erfðamengi hafa verið tengdir við taugaþroskaraskanir og geðraskanir með víðtækri
erfðamengisskimun.
Fjórar rannsóknir liggja til grundvallar þessari ritgerð, þar sem áhrifum breytileika í
erðamenginu á vitsmuni, byggingu og virkni heilans er lýst. Markmið
rannsóknarinnar er að dýpka skilning á orsökum taugaþroskaraskana, sem gæti
varðað leiðina að bættri greiningu og einstaklingsmiðaðri meðferð.
Aðferðir: Með því að arfgerðagreina einstaklinga, með kirnabreytileika á örflögum
og beita svo PENN-CNV algrími á gögnin, fundust arfberar eintakabreytileika. Meðal
arfbera eintakabreytileika sem tengdir hafa verið við áhættu á einhverfurófsröskun
og geðklofa, var einstaklingum sem ekki hafa fengið slíkar greiningar boðin þátttaka
í rannsókninni. Fyrir lokarannsóknina (vísindagrein IV), var erfðamengisraðgreiningu
beitt og þeir kirnabreytileikar í kóðunarröðum sem fundust voru auðkenndir til
frekari greiningar.
Þátttakendur leystu verkefni sem mæla ýmis vitsmunasvið, svo sem athygli,
rýmisvinnsluminni, rökhugsun, hugræna stýriferla (e. executive function),
sveigjanleika í hugsun, tungumálaskilning, vinnsluhraða og tilfinninganæmi.
Greindarvísitala (IQ) var mæld með Wechsler-skala og spurt um sértæka
námsörðugleika (lestur og stærðfræði), getu í daglegum athöfnum og svo var lagt
mat á geðheilsu og andlegt ástand með stuttu sálfræðiviðtali. Tölfræðivinnsla fór
fram með aðhvarfsgreiningu (generalised least-squares regression) með fylgibreytu
sem tekur mið af skyldleika þátttakenda. Marktækni var metin með því að leiðrétta
fyrir fjölda prófa og var hún miðuð við Bonferroni þröskuld.
iv
Segulómun var notuð til að safna myndum af heilum þátttakenda og myndirnar
sundur liðaðar eftir svæðum í hvítt efni, grátt efni og mænuvökva. Stöðluðum
aðferðum (SPM8) var beitt til að lýsa formi og byggingu heilans með stöðluðum
rúmeiningum (voxel-based morphometry) með Matlab-forriti sem gerir kleift að
meta rúmmál ákveðinna heilasvæða og rannsaka fylgni milli samantekta á
rúmeiningunum og arfgerðar með aðhvarfsgreiningu (multiple regression model).
Formgreining á yfirborði svæða og þykkt þeirra (surface-based morphometry) var
einnig framkvæmd. Enn fremur var notast við FreeSurfer-hugbúnað, sem finnur og
greinir fyrir fram skilgreind svæði og gefur þeim rúmmáls-, yfirborðsflatarmáls- og
þykktargildi sem síðan voru notuð í aðhvarfsgreiningu.
Starfrænum segulómunargögnum var einnig safnað. Tvö starfræn verkefni voru lögð
fyrir, eitt sem reynir á lesskilning, þar sem þátttakendur voru beðnir að ákveða hvort
orð sem birtist á skjánum hljómaði eins og alvöru orð eða ekki, og annað sem prófar
margföldunarskilning, þar sem þátttakendur lögðu mat á hvort lausn á
margföldunardæmi væri rétt. Gögnin voru meðhöndluð með birtum aðferðum og
tölfræðilega greind með SPM12. Rannsóknin var byggð á niðurstöðum úr
segulómun, þar sem einungis voru skoðuð fyrir fram ákveðin svæði.
Þinflæðismyndgreining (diffusion tensor imaging) var einnig beitt til að kortleggja
taugabrautir í heila þátttakenda. Myndgögn voru forunnin með FMRIB
hugbúnaðarsafninu. Mæling á því að hvaða leyti flæði (diffusion) stefnuhneigð
(fractional anisotropy) var metin með rúmeiningalíkani og aðhvarfsgreiningu
(multiple regression model).
Niðurstöður: Grein I. Tuttugu og sex eintakabreytileikar, sem hafa áður verið
tengdir við taugaþroskaraskanir og geðklofa (kallaðir Neuropsych CNVs), voru valdir.
Sýnt var fram á það að arfberar slíkra eintakabreytileika standa sig verr á ýmsum
vitsmunaprófum. Þeir sem bera 16p11.2 nær (proximal) brottfellingu, 17p12
brottfellingu eða 16p13.11 tvöföldun, sýndu sterkustu tengslin við skerðingu á
munnlegri og/eða verklegri greind. 15q11.2(brotsvæði 1-2) brottfellingin sýndi lítil
tengsl við greindarskerðingu en sterk tengsl við sértæku námsörðugleikana lesblindu
(dyslexiu) og reikniblindu/talnablindu (dyscalculia). Þátttakendur voru myndaðir
með segulómun til að skoða byggingu heilans. Þar sem 15q11.2(brotsvæði 1-2)
brottfellingin hefur áður verið tengd við geðklofa voru svæði áður tengd geðklofa
skoðuð hjá þeim sem bera brottfellinguna en eru ekki með geðklofagreiningu. Í ljós
kom að þessir einstaklingar eru með breytingar sambærilegar þeim sem greinast
með geðklofa; minnkað rúmmál gráa efnis í framhluta gyrðilberkis (perigenual
anterior cingulate cortex) og vinstra eyjarblaði (insula), minna rúmmál hvíta efnis
gagnaugablaðs (temporal lobe), í báðum heilahvelum, og aukið rúmmál af hvíta efni
hvelatengslana (corpus callosum), sem tengir heilahvelin. Það sem ekki hefur verið
v
sýnt fram á áður er að þeir sem bera gagnkvæma eintakabreytileikann,
15q11.2(brotsvæði 1-2) tvöföldunina, sýna gagnstæð áhrif á sömu svæði og sýna
breytingar í arfberum brottfellingarinnar. Niðurstaðan bendir til skammtaáhrifa
erfðavísana sem eru á þessu litningasvæði. Flestir þessara eintakabreytileika hafa
áhrif á frjósemi, sem skilgreind var sem fjöldi barna arfbera fyrir 45 ára aldur þar
sem að sterkustu áhrifin fylgja 16p11.2 nær (proximal) brottfellingunni og 22q11.21
tvöfölduninni, sérstaklega hjá körlum. Það styður þá kenningu að þessir
eintakabreytileikar séu undir neikvæðu vali.
Grein II. Í stærri framhaldsrannsókn þar sem allur heilinn var rannsakaður, var sýnt
að 15q11.2(brotsvæði 1-2) brottfellingin tengist auknu rúmmáli hvíta efnis í
framhluta tengihvels (anterior corpus callosum) og minnkuðu rúmmáli gráa efnis í
vinstri spólugára (left fusiform gyrus) og vinstri horngára (left angular gyrus).
Starfræn segulómun leiddi í ljós minni virkni í vinstri spólugára í lesskilningsverkefni,
og minni virkni í vinstri horngára í margföldunarverkefni hjá þeim sem bera
15q11.2(brotsvæði 1-2) brottfellinguna. Breytingar í spólugára hafa verið tengdar
við lesskilning og breytingar í horngára við talnaskilning. Í fyrri rannsókn var sýnt
fram á gagnkvæmar (speglaðar) breytingar í heilasvæðum á milli 15q11.2(brotsvæði
1-2) brottfellingarbera og tvöföldunarbera, en slíka speglun var ekki að sjá á
vitsmunaprófum. Jafnframt var engin marktæk fylgni á milli prófskora og
heilabreytna, sem kann að skýrast af litlu tölfræðilegu afli til að finna tengsl vegna
smæðar hópsins.
Grein III. Af þeim 26 eintakabreytileikum sem fjallað var um í grein I þá voru 19 enn
þá taldir uppfylla skilyrðið fyrir marktækri fylgni við einhverfurófsröskun eða
geðklofa. Fjórtán voru með nægjanlegt tölfræðiafl til að prófa og átta voru
marktækt tengdir ADHD. Tengslum við tvo þeirra hefur þegar verið lýst í birtum
vísindagreinum, við 16p13.11 tvöföldunina og 22q11.21 brottfellinguna, en tengsl
við hina sex eru ný, brottfellingar í 2p16.3 (NRXN1), 15q11.2 og 15q13.3 (BP4 &
BP4.5-BP5), og tvöfaldanir á 1q21.1 fjær (distal), 16p11.2 (nær) proximal, og
22q11.21. Sem hópur, sýndu allir 19 eintakabreytileikarnir marktæka fylgni við
ADHD, jafnvel eftir að einstaklingar með einhverfurófsröskun eða geðklofa voru
fjarlægðir úr þýðinu.
Grein IV. Greining á fylgni sjaldgæfra kirnabreytileika í kóðunarröðum við
greindarskerðingu eða lága greind, innan fjölskyldna, bar kennsl á þrjá breytileika
sem valda styttingu á próteinafurð MAP1B erfðavísisins í þremur íslenskum
fjölskyldum. Segulómun á heilum arfbera þessa kirnabreytileika sýndi verulega
minnkun á hvíta efni heilans, sérstaklega hvelatengslana. Þinflæðisgreining benti til
víðtækrar lækkunar á stefnuhneigð (fractional anisotropy) í öllum hvíta efnis
brautum heilans. Klínískt mat á segulómsgögnunum leiddi í ljós hnúða í
vi
heilahólfunum (periventricular nodular heterotopia) í níu af tíu berum þessara
breytileika. Rannsókn, þar sem plasmíð eru notuð til að tjá útgáfur af MAP1B geninu
með þessa þrjá kirnabreytileika, sýndi að stuttar útgáfur af próteininu geta verið
stöðugar.
Ályktanir: Taugaþroskaraskanir og geðraskanir geta verið mjög hamlandi.
Greindarskerðing, sem stundum er samfara þessum röskunum, getur truflað
greiningu þeirra. Til að einangra og rannsaka vitræna þáttinn voru valdir arfberar
eintakabreytileika, sem auka áhættu á einhverfurófsröskun eða geðklofa, en hafa
ekki fengið greiningu á þessum röskunum. Ýmis vitræn próf voru lögð fyrir þessa
einstaklinga og heilar þeirra kannaðir með segulómun. Rannsóknin leiddi í ljós
sértækar greindarskerðingar og heilabreytingar sem svipar til þeirra sem eiga sér
stað hjá þeim sem greinast með geðklofa. Út frá þessum niðurstöðum spratt sú
tilgáta að breytingar á vitsmunum séu ekki endilega afleiðing geðraskana, heldur
geti þær jafnvel miðlað hluta af sjúkdómsáhættunni. Sömu rannsóknaraðferðir voru
notaðar til að uppgötva tengsl á milli eintakabreytileika og sértækrar námsröskunar,
án greindarskerðingar, og breytinga í uppbyggingu og virkni heilans, sem áður höfðu
verið tengdar við lesskilning og margföldunarskilning. Einnig fundust breytingar í
basaröð sem styttir próteinafurð gens og tengjast mjög sterklega við
greindarskerðingu og verulegum breytingum í hvíta efni heilans. Niðurstöðurnar
sýna að áhrif þessara eintakabreytileika, sem sýna fylgni við taugaþroskaraskanir og
geðsjúkdóma, teygjast yfir í aukna áhættu á ADHD og varpa þannig ljósi á fjölbreytt
áhrif þessara eintakabreytileika. Niðurstöðurnar benda til þess að
taugaþroskaraskanir og geðraskanir séu ekki aðgreindar heldur tengdar raskanir.
Dæmin hér að ofan sýna fram á þá kosti sem aðferðir erfðafræðinnar bjóða upp á til
þess að aðgreina einkenni og teikn sjúkdóma, sem gerir rannsóknir á tengslum
breytinga í heila og vitsmuna mun markvissari.
Læst til 31.12.2026