Modelling metabolomic changes in human bone marrow derived mesenchymal stem cells during oesteogenic differentiation via genome scale metabolic models to further their use in regenerative medicine

Abstract

Á undanförnum árum hafa sviðin endurnýjunar og tilfærslu lækningar vakið sífellt meiri áhuga vegna möguleikanna sem í þeim felast er varða nýjungar í læknavísindum. Innan þeirra má finna ýmis tól sem talin eru vera lykilatriði þegar kemur að því að finna og þróa ný meðferðarúrræði, og er eitt þessara tóla notkun mesenkýmal stofnfrumna (MSF). MSF hafa verið rannsakaðar m.t.t. ýmissa þátta þ.á.m. getu þeirra til að bæta endurnýjun beina og endurbyggingu beinvefs. Þrátt fyrir margvíslegar rannsóknir og meðfylgjandi framfarir í áttina að mögulegri klínískri notkun er margt sem er enn óljóst er varðar virkni og möguleika þessara frumna. Nákvæm og skipulögð rannsókn ásamt tiltölulega nákvæmum tölvulíkönum sem geta hermt eftir efnaskiptabreytingum og líkt eftir samfylgjandi svipgerðum gætu verið leiðir til að stoppa upp í núverandi göt í þekkingu hvað varðar efnaskiptabreytingar, frá tjáningu gena til framleiðslu próteina, ásamt því að veita möguleika á tilgátuprófunum án meðfylgjandi kostnaðar. Markmið verkefnisins sem hér er kynnt var að rannsaka efnaskiptabreytingar í mennskum MSF við beinsérhæfingu til að reyna að skilgreina mögulega efnaskipta fasa sem beinsérhæfingartímabilið væri samsett úr og búa til in silico módel byggð á genatengdum upplýsingum til að líkja eftir breytingunum. Í fyrsta hluta þessa verkefnis var notast við innan- og utanfrumu metabolómísk gögn til að skilgreina möguleg mismunandi stig beinsérhæfingar og hvaða efnaskiptabrautir geta legið þar að baki. Eftir greiningu gagna var lögð var fram tilgáta um tilveru þriggja mismunandi fasa og merkt innanfrumu gögn bentu til dvínandi virkni í glýkólýsu í gegnum sérhæfingartímann á sama tíma og aukningu gætti í hvatbera tengdum orkugefandi ferlum eftir því sem leið á. Þessar niðurstöður geta hjálpað með að finna tímapunkta sem eru af sérstökum áhuga er varðar kortlagningu mikilvægra efnaskiptabreytinga. Í öðrum hluta verkefnisins var notast við utanfrumu metabólómísk gögn sem safnað var frá mennskum MSF einangruðum úr beinmerg sem ræktaðar voru við venjulega skiptingu, fitu- og beinsérhæfingu, og þau notuð ásamt sértækum tilraunatengdum gögnum til að búa til þrjú sambærileg in silico módel, þau fyrstu sinnar gerðar, er líkja eftir efnaskiptabreytingum þessara þriggja frumugerða fyrstu 7 daga ræktunar. Módelin voru öll líffræðilega möguleg og sýndu af sér öll helstu einkennandi hvörf sem virk. Við greiningu og samanburð á módelunum fundust helstu breyttu undirkerfi og efnaskiptaferlar er voru einkennandi fyrir hverja frumugerð fyrir sig. Í tilviki frumna í venjulegri skiptingu voru breytt kerfi mjög fjölbreytt sem endurspeglar þær fjölbreyttu kröfur sem fruma þarf að uppfylla við að búa til annað eintak af sér, í tilviki fitusérhæfingar var nýmyndun og oxun fitusýra hvað mest áberandi og oxun fitusýra ásamt flutnings hvörfum einkenndu beinsérhæfingu. Þessi módel má nota til að sigta úr og setja upp ákjósanlegar tilraunir til að besta beinsérhæfingu og með breytingum mætti búa til sjúkdómsmódel til að líkja eftir beinþynningu. Í þriðja þætti verkefnisins sem hér er kynnt hafa verið tekið saman þau margvíslegu einkenni og fjölmörgu möguleikar er felast í MSF sem tóli til að nýta í endurnýjunar lækningum og vefjaverkfræði og hvernig, með notkun in silico efnaskiptamódela byggðum á genaupplýsingum, þá möguleika mætti þróa áfram á skilvirkari og hraðari máta samtímis því að lækka tilraunatengdan kostnað. Þetta verkefni hefur lagt sitt af mörkum er kemur að því að minnka núverandi eyðu þekkingar er varðar efnaskiptabreytingar er eiga sér stað í gegnum beinsérhæfingu mennskra MSF og hefur komið með að borðinu ný tól sem geta nýst til frekari rannsókna á sama sviði meðfram því að geta gert þær skilvirkari og hagkvæmari.

hefur komið með að borðinu ný tól sem geta nýst til frekari rannsókna á sama sviði meðfram því að geta gert þær skilvirkari og hagkvæmari.

In recent years the fields of regenerative and translational medicine have become the subjects of significantly growing interest due to their offer of previously unimaginable therapeutics. Within these fields are several novel tools believed to hold the keys to furthering existing and new developments and one of those tools is human mesenchymal stem cells. One of the applications hMSCs have been studied for is enhanced osteogenic regeneration or reconstruction of new bone tissue. Although various studies have been performed and some strides been made towards a plausible clinical application there is still lot left to be discovered. A methodical studying and relatively detailed in silico genome scale metabolic modelling occurring changes and the accompanying metabolic phenotypes could provide a means to fill in the existing knowledge gaps (from the protein level all the way to the genomic level) and, additionally, a means to perform hypotheses testing with a significant reduction when it comes to the accompanying cost. The objective of this thesis was to study the metabolomic changes in hMSCs during osteogenic differentiation using original transcriptomic, intracellular and extracellular metabolomic data in order try and define possible metabolic stages over the course of the differentiation and use genome scale network reconstruction to create in silico models. In the first part of this work extracellular and intracellular data were used to define possible stages to osteogenic differentiation and hypothesise which pathways may characterise the different metabolic phenotypes. Three stages were suggested based on the data and labelled intracellular metabolomics indicated a decrease in glycolytic dependencies throughout the differentiation period with an increase in mitochondria related energy producing functions as the osteogenesis progressed. This will help focus specific time points of interest and relevance when it comes to mapping the significant metabolomic changes. In the second part of this work extracellular metabolomic data collected from BM-hMSCs during proliferation, adipogenic and osteogenic differentiation was used along with experimentally specific data to create three directly comparable genome scale metabolic models, two of which have no comparable predecessors, for those cell lineages during the first 7 days of cell culture. Models were biologically feasible and showed all lineage specific characteristic reactions as active. By analysis and comparison, the various enriched subsystems and pathways most significant for each lineage were found. Results were varied for proliferating cells, which matches that they have to synthesise various metabolites and substances to expand, whilst fatty acid oxidation and fatty acid synthesis was most prominent in adipogenesis with fatty acid oxidation as well as transport reactions characteristic for osteogenesis. These models can be used for model-driven experimental design to engineer osteogenesis and, with modifications, to create disease model for osteoporosis. In the third part presented we summarized the various characteristics and possibilities that lie in using MSCs as a tool in tissue engineering and regenerative medicine and how, via implementation of genome scale metabolic model reconstruction, their possibilities could possibly be taken much further in a faster, more methodical manner while reducing the related experimental cost. To summarise, this work has provided real strides when it comes to closing the existing gap regarding metabolomic changes during differentiation of hMSCs as well as providing novel tools that can be used to make further studies more efficient and cost effective.