Thermal Stabilization of Oxytocin and Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)

Abstract

Oxytocin is a uterotonic neuropeptide. It has been recommended by the World Health Organization (WHO) as the first line treatment to prevent and treat postpartum hemorrhage (PPH). PPH is the main cause of maternal deaths (27.1%) in many low-income countries. Basic fibroblast growth factor (FGF2) is one of the family members of fibroblast growth factors. It has been shown to regulate many cellular functions including cell proliferation, migration, and differentiation, as well as angiogenesis in a variety of tissues, including skin, blood vessel, muscle, adipose, tendon/ligament, cartilage, bone, tooth, and nerve. Both FGF2 and oxytocin are unstable and degrade rapidly at room temperature. It has been shown the reconstituted FGF2 solutions are stable for only about one week at 4 ℃ and data shows that oxytocin cannot tolerate being stored at 30°C for more than one month or 2 weeks at 40°C. The aim of this project was to enhance the thermal stability of oxytocin and do preliminary studies on FGF2 in aqueous solutions, which could improve the products shelf-lives. D-(+)-glucosamine hydrochloride, tetraethyleneglycol (4EG), N-acetyl-D-glucosamine and the mixture of these additives were tested on the stability of oxytocin and FGF2. Our findings showed that all these additives had destabilizing effect on FGF2 stability in PBS. Tetraethylene glycol and D-(+)- glucosamine hydrochloride had a destabilizing effect on oxytocin in both phosphate buffer and acetate buffer. N-acetyl-D-glucosamine showed a negligible or possibly slight improvement to the stability of oxytocin. The effect of trehalose on stability of FGF2 and oxytocin in aqueous buffer solutions was also tested. Although trehalose showed small to negligible effect on oxytocin stability even at a concentration of 1.0 M in acetate buffer, it slowed down the degradation rate of FGF2 in the presence of all buffers used (HEPES, TRIS, citrate/phosphate and PBS). The effect of different buffers was evaluated as well. Oxytocin was found to be more stable in acetate buffer than citrate/phosphate buffer or phosphate buffer and we found that the stability is also concentration dependent with acetate buffer concentrations of 0.025 M or less being more beneficial. FGF2 showed the most stablility in PBS buffer compared with the other buffers used. The effect of crown ethers on the stability of oxytocin and FGF2 in aqueous solution was also explored. 18-crown-6 and 12-crown-4 had destabilizing effect on FGF2. We explored that while 12-crown-4 and 15-crown-5 did not stabilize oxytocin, 18-crown-6 showed to enhance significantly oxytocin stability in citrate/phosphate buffer at pH 4.5. However, in acetate buffer at the same pH, the presence of 18-crown-6 had a destabilizing effect, possibly leading to a different degradation pathway. The effect of antioxidants such as uric acid, butylated hydroxytoluene, and L-ascorbic acid was also tested on oxytocin stability in solution. Despite known degradation pathways of oxytocin including oxidation of certain amino acids, the antioxidants uric acid and butylated hydroxytoluene had negligible effect on the oxytocin stability while L-ascorbic acid led to significantly faster degradation. The effect of different pH on FGF2 stability in citrate/phosphate buffer at a pH range (6-8) and acetate buffer at pH 4.5 and 5.5 showed that like other FGF family members, FGF2 is more stable in near-neutral to basic pH compared with acidic pH.

Oxýtósin er legæða taugapeptíð sem Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin ráðleggur að sé notað sem fyrsta stigs vörn til að fyrirbyggja og meðhöndla blæðingar eftir fæðingu. Blæðingar eftir fæðingu eru aðal dánarorsök mæðra (27.1%) í mörgum löndum þar sem tekjur eru lægri. Basíski fibroblast vaxtaþátturinn (FGF2) er hluti af fjölskyldu fibroblast vaxtaþátta. Það tekur þátt í að stýra ýmissi frumustarfsemi, þar á meðal frumufjölgun, flæði, aðgreiningar, sem og æðamyndunar í ýmsum vefjum svo sem húð, æðum, vöðvum, figu, sinum/liðböndum, brjóski, bein, tennum og taugum. Bæði FGF2 og oxýtósin eru óstöðug og brotna hratt niður við stofuhita. Sýnt hefur verið fram á að FGF2 vatnslausnir eru einungis stöðugar í um viku við 4°C og gögn hafa sýnt að oxýtósin þolir ekki geymsu við 30°C í meira en mánuð eða 2 vikur við 40°C. Markmið þessa verkefnis var að auka hitastöðugleika oxýtósins og gera frumrannsóknir á FGF2 í vatnslausnum til að auka geymsluþol þessara efna. D-(+)-glúkósamín hýdróklóríð, tetraetýlenglýkól (4EG), N-acetýl-D-glúkósamín og blanda af þessum viðbótarefnum voru prófuð til að sjá áhrif þeirra á stöðugleika oxýtósins og FGF2. Niðurstöður okkar sýna að öll þessara efna gerðu FGF2 óstöðugra í fosfat buffer salín (PBS) lausn. 4EG og D-(+) glúkósamín hýdroklóríð gerðu oxýtósin óstöðugra í bæði fosfat og asetat stuðpúðalausnum. N-acetýl-D-glúkósamín sýndi hverfandi eða hugsanlega örlítið stöðgandi áhrif á oxýtósin. Áhrif trehalósa á stöðugleika FGF2 og oxýtósins í vatns stuðpúðalausnum var líka prófað. Þrátt fyrir að trehalósi sýndi lítil sem hverfandi áhrif á stöðugleika oxýtósin jafnvel við allt að 1,0 M styrk í asetat stuðpúðalausn, þá hægði það á niðurbrotshraða FGF2 í viðurvist allar stuðpúðalausnanna sem voruð notaðir (HEPES, TRIS, sítrate/fosfat og PBS). Áhrif mismunandi stuðpúðalausna voru líka metin. Oxýtósin reyndist vera stöðugra í acetat stuðpúðalausn heldur en sítrat/fosfat eða fosfat stuðpúðalausn og við sáum að stöðugleikinn er líka stykháður, þar sem asetat stuðpúðalausnir með styrk 0,025 M eða lægra er betra. FGF2 var stöðugast í PBS í samanburði við aðra stuðpúða sem voru notaðir. Áhrif kórónuetera á stöðugleika oxýtósins og FGF2 í vatnslausnum var líka kannað. 18-kóróna-6 og 12-kóróna-4 höfðu neikvæð áhrif á stöðugleika FGF2. Við sáum að á meðan 12-kóróna-4 og 15-kóróna-5 höfðu ekki stöðgandi áhrif á oxýtósin, þá hafði 18- kóróna-6 stöðgandi áhrif á óxýtósin í sítrate/fosfat stuðpúðalausn við pH 4,5. Hins vegar hafði viðurvist 18-kóróna-6 neikvæð áhrif á stöðugleikann í asetat stuðpúðalausn við sama pH, og leiddi mögulega til annars niðurbrotsferlis. Áhrif andoxunarefna, svo sem þvagsýru, bútýlað hýdroxýtóluen (BHT) og Lascorbic sýru var líka prófað fyrir stöðugleika oxýtósins í lausn. Þrátt fyrir að þekktar niðurbrotsleiðir fyrir oxýtósin innihaldi oxun á ákveðnum amínósýrum, þá höfðu andoxunarefnin þvagsýra og BHT hverfandi áhrif á stöðugleika oxýtósins á meðan Lascorbic sýran leiddi til hraðara niðurbrots. Áhrif mismunandi sýrustiga á stöðugleika FGF2 í sítrat/fosfat stuðpúðalausn við pH 6-8 og asetat stuðpúðalausn við pH 4,5 og 5,5 sýndi að líkt og önnur prótín í FGF fjölskyldunni, þá er FGF2 stöðugra við sýrustig sem er nálægt hlutlausu eða örlítið basískt í samanburði við súrt pH.