Synthesis of DNA and RNA containing rigid spin- and fluorescent labels for studies by EPR and fluorescence spectroscopies

Abstract

To gain information about the function of nucleic acids, their structure and dynamics need to be investigated. Electron paramagnetic resonance (EPR)- and fluorescence spectroscopies are highly sensitive and valuable techniques to study nucleic acids. These methods require incorporation of spin- and fluorescent labels prior to measurements. This doctoral dissertation focuses on the synthesis of rigid spin- and fluorescent labels and their incorporation into DNA and RNA for the study of structure and dynamics of nucleic acids by EPR- and fluorescence spectroscopies. The first part of the thesis describes a protecting group strategy to address a longstanding problem associated with spin-labeling by chemical synthesis of nucleic acids, namely reduction of nitroxides during solid-phase synthesis. A benzoyl group was used to protect the nitroxide by reducing the nitroxide to the corresponding hydroxylamine, followed by benzoylation. The method was used to incorporate the rigid spin label Çm into RNA with quantitative spin-labeling efficiency. This protecting-group strategy can be used as a general method to incorporate nitroxide spin-labels into nucleic acids by the phosphoramidite approach. The second part of this thesis focuses on labeling of specific nucleic acids with rigid spin- and fluorescent labels, namely Ç, Çm and Çmf. The rigid spin labels Ç and Çm were incorporated into DNA and RNA, respectively, for measurements in the research group of Prof. Thomas F. Prisner at the Goethe University in Frankfurt, by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy. Furthermore, Çmf, the fluorescent derivative of Çm, was incorporated into various RNAs to investigate them by fluorescence spectroscopy, by the research group of Prof. Josef Wachtveitl at the Goethe University in Frankfurt. The third part of the thesis describes the design and synthesis of the new rigid spin labels Ċ and Ċm for DNA and RNA, respectively, that are carbazole-derived nitroxides and analogues of cytidine. Crystal structure analysis indicated that Ċ and Ċm are more rigid than the rigid spin labels Ç and Çm. Ċ and Ċm were incorporated into several oligonucleotides and showed to be non-perturbing of duplex structure. These new rigid spin labels are promising candidates for future studies of DNA and RNA structures and dynamics by pulsed EPR methods.

Til að fá vitneskju um virkni kjarnsýra er nauðsynlegt að rannsaka byggingu og hreyfingu þeirra. Litrófsgreiningar sem byggja á rafeindasegulómun (e. electron paramagnetic resonance, EPR) og fljúrljómun eru mjög næmar og gagnlegar aðferðir til að rannsaka kjarnsýrur. Til að unnt sé að beita slíkum mæliaðferðum er nauðsynlegt að innleiða meðseglandi- og flúrljómandi merki inn í kjarnsýrurnar. Þessi doktorsritgerð lýsir efnasmíði á stífum spuna- og flúrljómandi merkjum og innleiðingu þeirra inn í DNA og RNA til rannsókna á byggingu og hreyfingu kjarnsýra með EPR- og flúrljómunarlitrófsgreiningum. Fyrsti hluti ritgerðarinnar lýsir hvernig tekið var á þrálátu vandamáli sem tengist spunamerkingu kjarnsýra, nánar tiltekið afoxun nítroxíða þegar kjarnsýrur eru smíðaðar á föstu efni (e. solid-phase synthesis). Bensóýl hópur var notaður til að vernda nítroxíðið með því að afoxa það í hýdroxýlamín, sem í kjölfarið var bensóýlað. Þessi aðferð var notuð til að innleiða stífa spunamerkið Çm ólaskað inn í RNA. Þessa verndunaraðferð ætti að nýtast almennt til að innleiða nítroxíð spunamerki inn í kjarnsýrur með fosfóramidíð efnasmíðum (e. phosphoramidite approach). Í öðrum hluta ritgerðarinnar er fjallað um merkingu ákveðinna kjarnsýra með stífum spuna- og flúrljómandi merkjum, nánar tiltekið Ç, Çm og Çmf. Stífu spunamerkin Ç og Çm voru innleidd í DNA og RNA sameindir til rannsókna í rannsóknarhópi prófessor Thomas F. Prisner við Goethe Háskólann í Frankfurt, með PELDOR (e. pulsed electron-electron double resonance) litrófsgreiningu. Þar að auki var Çmf, flúrljómandi afleiðan af Çm, innleidd í ýmsar RNA sameindir til rannsókna með flúrljómun í rannsóknarhópi prófessor Josef Wachtveitl við Goethe Háskólann í Frankfurt. Loks lýsir þriðji hluti ritgerðinnar hönnun og smíði á nýjum stífum spunamerkjum, Ċ og Ċm, fyrir DNA og RNA, sem hafa karbasól byggingu og eru afleiður af sýtidíni. Kristalgreining bendir til að Ċ og Ċm séu enn stífari en spunamerkin Ç og Çm. Ċ og Ċm voru innleidd í ýmis fákirni (e. oligonucleotides) og var sýnt fram á að Ċ og Ċm raska ekki byggingu tvístrendinga (e. duplex). Þessi nýju stífu spunamerki eru vænleg fyrir rannsóknir á byggingu og hreyfingu DNA og RNA með púlsuðum EPR mælingum.