Advancements in site-directed incorporation of rigid spin-labels into nucleic acids

Abstract

Rafeindasegullitrófsgreiningu (e. Electron Paramagnetic Resonance, EPR) er reglubundið beitt í rannsóknum á byggingu og hreyfingu kjarnsýra til að fá upplýsingar um starfsemi þeirra og hlutverk. Innleiðing meðseglandi kjarna á ákveðinn stað í kjarnsýrum er nauðsynleg fyrir EPR mælingar og er það gert með aðferð sem kallast staðbundin spunamerking. Þessi doktorsritgerð lýsir betrumbótum á staðbundinni spunamerkingu á kjarnsýrum með notkun stífra spunamerkja. Fyrsti hluti ritgerðarinnar lýsir þróun á aðferð til verndunar nítroxíð stakeinda til að koma í veg fyrir afoxun þeirra þegar spunamerktar kjarnsýrur eru útbúnar með efnasmíði. Notast var við bensóylverndað hýdroxylamín til verndunar á nítroxíðinu. Þessi aðferð var notuð til að innleiða stífa spunamerkið Ç inn í DNA kjarnsýrur og lofar góðu sem almenn aðferð til þess að innleiða spunamerki í kjarnsýrur með fosfóramíðít efnasmíði. Í öðrum hluta ritgerðarinnar er efnasmíði á spunamerkjunum EÇ og EÇm lýst, en bæði eru stöðug við afoxandi aðstæður. Þessi spunamerki eru ætluð til notkunar við innan-fruma EPR mælingar á kjarnsýrum. Bæði spunamerkin eru stíf, sem gerir mögulegt að fá nákvæmar upplýsingar um byggingu og hreyfingu kjarnsýra með EPR. EÇ var innleitt í DNA og EÇm í RNA með kjarnsýruefnasmíði. EÇm afoxaðist að hluta til á meðan á RNA smíðinni stóð en þá afoxun var unnt að koma í veg fyrir með fyrrnefndri bensóyl verndun nítroxíðsins. Sýnt var fram á að EÇ og EÇm breyttu ekki byggingu DNA og RNA tvíliða. Þriðji hluti ritgerðarinnar lýsir efnasmíðum á o-bensókvinón afleiðum af ísóindólíni og þéttingu þeirra með o-fenýlentvíamínum til að mynda ísóindólín-fenasín afleiður. Í kjölfarið voru þær oxaðar í fenasín-tví-N-oxíð nítroxíð og kannað hvort unnt væri að nota þær til spunamerkinga án samgildra tengja á tvístrendum DNA og RNA kjarnsýrum sem innihalda basalausar stöður. Ósetið fenasín-N,N-tvíoxíð tetrametýlísóindólín nítroxíð sýndi mikla sækni í basalausa stöðu í DNA á móti basanum C.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is routinely used to study the structure and dynamics of nucleic acids to obtain information about their functions. Incorporation of a paramagnetic center into nucleic acids is necessary prior to EPR measurements. This doctoral dissertation focuses on improvements in nitroxide spin-labeling of nucleic acids for structure determination using rigid spin labels. The first part of this thesis describes the development of a protecting group strategy for nitroxide radicals to circumvent their reduction during the chemical synthesis of DNA. Specifically, a benzoylated hydroxylamine was used as a protected form of the nitroxide. This method was used to incorporate the rigid spin label Ç into DNA oligonucleotides and represents a general strategy for spin labeling nucleic acids using the phosphoramidite method. In the second part of the thesis, the synthesis of the reduction-resistant spin labels EÇ and EÇm is described, nitroxides that will facilitate application of EPR spectroscopy for the investigation of nucleic acids within cells. Both labels possess rigidity for extracting detailed information about structure and dynamics by EPR. EÇ and EÇm were incorporated into DNA and RNA, respectively, by oligonucleotide synthesis. Partial reduction of EÇm during RNA synthesis was observed but was circumvented by using the aforementioned benzoyl protecting group strategy. EÇ and EÇm were shown to be non-perturbing of duplex DNA and RNA structures, respectively. The third part of this thesis describes the synthesis of o-benzoquinone derivatives of isoindoline and their condensation with o-phenylenediamines to form isoindoline-phenazines. Subsequent oxidation gave phenazine-di-N-oxide radicals that were evaluated for noncovalent spin-labeling of duplex DNA and RNA containing abasic sites. No specific binding was observed for RNA, but an unsubstituted phenazine-N,N-dioxide tetramethyl isoindoline nitroxide showed high binding affinity and specificity towards abasic sites in duplex DNA opposite to C.