The MITF, TFEB, TFE3 and TFEC (MiT-TFE) proteins belong to a larger family
of basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factors that are able to bind
DNA and regulate gene expression. MITF is crucial for melanocyte
development and has been called a lineage specific oncogene in melanoma
whereas its relatives, TFEB and TFE3 are involved in the biogenesis and
function of lysosomes and autophagosomes, regulating cellular clearance
pathways. Autophagy is a biological process that plays a prominent role in
human disease and can also have an impact on the outcome of therapeutic
approaches. Whether MITF, TFEB and TFE3 regulate each others expression
and whether they cooperate in the regulation of gene expression is presently
unknown.
I have investigated the interactions and cross-regulatory relationship of
MITF, TFE3 and TFEB in melanoma cells. Like MITF, the TFEB and TFE3
genes are expressed in melanoma cells and tissues. I show that these factors
regulate each other’s expression. Also, using co-immunoprecipitation studies,
I demonstrate that MITF, TFEB and TFE3 are able to heterodimerize in
melanoma cells. However, they fail to interact with other members of the bHLH
family such as MAX. Furthermore, I show that a three amino acid region
present in the HLH-Zip region is responsible for dimerization specificity. In
addition, several signaling pathways can post-translationally modify these
factors, affecting their nuclear localization, activity and stability. Reporter gene
and ChIP assays show that the three factors are able to bind and activate
similar DNA regulatory motifs and drive the expression of genes involved in
autophagy and pigmentation. Interestingly, some genes are exclusively
regulated by one of the factors.
The relationship between MITF, TFEB and TFE3 is complex and involves
regulation of gene expression, protein-protein interactions resulting in
complementary functions. It is important to further unravel this relationship in
melanoma to gain a better understanding of the cross-regulatory mechanisms
involved and how these factors regulate lysosomal function.
Stjórnpróteinin MITF , TFEB, TFE3 og TFEC (stundum nefnd MiT-TFE
þættirnir) tilheyra bHLHZip fjölskyldu umritunarþátta sem bindast DNA og
stjórna tjáningu gena. MITF er mikilvægt fyrir myndun og starfsemi litfruma en
ættingjar þess, TFEB og TFE3, stjórna myndun og starfsemi lysósóma og
sjálfsáti. Sjálfsát er líffræðilegt ferli sem gegnir mikilvægu hlutverki í starfsemi
fruma en getur einnig haft áhrif á myndun og meðhöndlun sjúkdóma.
Í verkefni þessu var samstarf MITF, TFE3 og TFEB próteinanna skoðað í
sortuæxlisfrumum og hvaða áhrif þau hafa á tjáningu hvers annars. Eins og
MITF eru TFEB og TFE3 genin tjáð í sortuæxlisfrumum og sortuæxlum; TFEC
er ekki tjáð í þessum frumum og var því ekki skoðað í þessu verkefni. Með
notkun sérvirkra hindra var sýnt að boðleiðir hafa áhrif á staðsetningu
próteinanna þriggja í sortuæxlisfrumum. Umritunarþættir þessir geta bundist
skyldum DNA-bindisetum og haft áhrif á tjáningu gena sem eru nauðsynleg
fyrir myndun bæði lýsósóma og melanósóma. Áhugavert er að hver
umritunarþáttanna þriggja stjórnar tjáningu gena sem hinir hafa engin áhrif á
en ekki er ljóst hvernig þessari takmörkun er stjórnað. Þessi þættir stjórna
tjáningu hvers annars, bæði beint og óbeint. Með mótefnisfellingu kom í ljós
að MITF, TFEB og TFE3 geta myndað mistvenndir í æxlisfrumum en geta ekki
myndað mistvenndir með öðrum bHLHZip próteinum eins og MAX. Þriggja
amínósýru-svæði, sem er til staðar í HLH-Zip svæðinu, er nauðsynlegt fyrir
þessa sértæku tvenndarmyndun. Hlutverk þessara amínósýra var greint frekar
og, með tilfærslu þessara þriggja amínósýra, var reynt að útbúa MITF prótein
sem einungis geta myndað einstvenndir. Það tókst ekki en áhugaverðar
upplýsingar fengust um hvernig tvenndarmyndun MITF fer fram.
Niðurstaðan er að sambandið milli MITF, TFEB og TFE3 í
sortuæxlisfrumum er flókið og felst í áhrifum á stjórnun genatjáningar,
samstarfi próteina með myndun mistvennda og áhrifum boðleiða á
staðsetningu í frumulíffærum. Mikilvægt er að greina og skilja þetta samband í
sortuæxlum til að öðlast betri skilning á því hvernig unnt er að hafa áhrif á þau
ferli sem umritunarþættir þessir stjórna.
