A network of bHLHZip transcription factors in melanoma: Interactions of MITF, TFEB and TFE3

Abstract

The MITF, TFEB, TFE3 and TFEC (MiT-TFE) proteins belong to a larger family of basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factors that are able to bind DNA and regulate gene expression. MITF is crucial for melanocyte development and has been called a lineage specific oncogene in melanoma whereas its relatives, TFEB and TFE3 are involved in the biogenesis and function of lysosomes and autophagosomes, regulating cellular clearance pathways. Autophagy is a biological process that plays a prominent role in human disease and can also have an impact on the outcome of therapeutic approaches. Whether MITF, TFEB and TFE3 regulate each others expression and whether they cooperate in the regulation of gene expression is presently unknown. I have investigated the interactions and cross-regulatory relationship of MITF, TFE3 and TFEB in melanoma cells. Like MITF, the TFEB and TFE3 genes are expressed in melanoma cells and tissues. I show that these factors regulate each other’s expression. Also, using co-immunoprecipitation studies, I demonstrate that MITF, TFEB and TFE3 are able to heterodimerize in melanoma cells. However, they fail to interact with other members of the bHLH family such as MAX. Furthermore, I show that a three amino acid region present in the HLH-Zip region is responsible for dimerization specificity. In addition, several signaling pathways can post-translationally modify these factors, affecting their nuclear localization, activity and stability. Reporter gene and ChIP assays show that the three factors are able to bind and activate similar DNA regulatory motifs and drive the expression of genes involved in autophagy and pigmentation. Interestingly, some genes are exclusively regulated by one of the factors. The relationship between MITF, TFEB and TFE3 is complex and involves regulation of gene expression, protein-protein interactions resulting in complementary functions. It is important to further unravel this relationship in melanoma to gain a better understanding of the cross-regulatory mechanisms involved and how these factors regulate lysosomal function.

Stjórnpróteinin MITF , TFEB, TFE3 og TFEC (stundum nefnd MiT-TFE þættirnir) tilheyra bHLHZip fjölskyldu umritunarþátta sem bindast DNA og stjórna tjáningu gena. MITF er mikilvægt fyrir myndun og starfsemi litfruma en ættingjar þess, TFEB og TFE3, stjórna myndun og starfsemi lysósóma og sjálfsáti. Sjálfsát er líffræðilegt ferli sem gegnir mikilvægu hlutverki í starfsemi fruma en getur einnig haft áhrif á myndun og meðhöndlun sjúkdóma. Í verkefni þessu var samstarf MITF, TFE3 og TFEB próteinanna skoðað í sortuæxlisfrumum og hvaða áhrif þau hafa á tjáningu hvers annars. Eins og MITF eru TFEB og TFE3 genin tjáð í sortuæxlisfrumum og sortuæxlum; TFEC er ekki tjáð í þessum frumum og var því ekki skoðað í þessu verkefni. Með notkun sérvirkra hindra var sýnt að boðleiðir hafa áhrif á staðsetningu próteinanna þriggja í sortuæxlisfrumum. Umritunarþættir þessir geta bundist skyldum DNA-bindisetum og haft áhrif á tjáningu gena sem eru nauðsynleg fyrir myndun bæði lýsósóma og melanósóma. Áhugavert er að hver umritunarþáttanna þriggja stjórnar tjáningu gena sem hinir hafa engin áhrif á en ekki er ljóst hvernig þessari takmörkun er stjórnað. Þessi þættir stjórna tjáningu hvers annars, bæði beint og óbeint. Með mótefnisfellingu kom í ljós að MITF, TFEB og TFE3 geta myndað mistvenndir í æxlisfrumum en geta ekki myndað mistvenndir með öðrum bHLHZip próteinum eins og MAX. Þriggja amínósýru-svæði, sem er til staðar í HLH-Zip svæðinu, er nauðsynlegt fyrir þessa sértæku tvenndarmyndun. Hlutverk þessara amínósýra var greint frekar og, með tilfærslu þessara þriggja amínósýra, var reynt að útbúa MITF prótein sem einungis geta myndað einstvenndir. Það tókst ekki en áhugaverðar upplýsingar fengust um hvernig tvenndarmyndun MITF fer fram. Niðurstaðan er að sambandið milli MITF, TFEB og TFE3 í sortuæxlisfrumum er flókið og felst í áhrifum á stjórnun genatjáningar, samstarfi próteina með myndun mistvennda og áhrifum boðleiða á staðsetningu í frumulíffærum. Mikilvægt er að greina og skilja þetta samband í sortuæxlum til að öðlast betri skilning á því hvernig unnt er að hafa áhrif á þau ferli sem umritunarþættir þessir stjórna.