Cell factory and cell-free conversion of brown seaweed into valuable compounds by metabolic engineering

Abstract

In the context of fossil fuel shortage and the need for more sustainability, recent emphasis has been put on finding new biomasses suitable for biotechnological applications, such as brown seaweed. They are the most abundant seaweed in Northern Europe and contain laminarin and alginate as main carbohydrates. The aim of this study was to utilize this biomass as a feedstock for microorganisms, using metabolic engineering, both in vivo and in vitro, to improve conversion of these carbohydrates to value-added products. The anaerobic thermophilic bacteria Thermoanaerobacterium AK17 was used as a cell factory and engineered to produce ethanol as the sole fermentation product. The resulting strain AM6 reached an ethanol yield close to the maximum theoretical yield (95%), using mannitol, glucose and oligosaccharides from seaweed hydrolysate. Further genetic manipulations could increase the productivity of this new strain, by enabling the use of alginate and by increasing the ethanol tolerance. A cell-free approach was also considered, and a cascading enzymes reaction was designed to produce KDG, a precursor for bioplastic production, from alginate and laminarin, using different thermophilic enzymes. After fine tuning various enzymatic parameters, such as pH and temperature, KDG could be produced from alginate, but further optimizations are needed to produce it also from laminarin. In this context, a gene encoding a novel laminarinase was cloned and the recombinant enzyme characterized. Overall, this study is a proof of concept for brown seaweed valorization using metabolic engineering and paves the way toward a more sustainable world.Brúnþörungar, sem vaxa við Íslandsstrendur, hafa vakið athygli og áhuga sem hráefni fyrir líftækniiðnað, sérstaklega í ljósi minnkandi aðgengis að jarðefnaeldsneyti og aukinnar þarfar fyrir sjálfbærar lausnir í umhverfismálum. Brúnþörungar eru ríkir af sykrum og hafa þann kost fram yfir landplöntur að þeir krefjast hvorki ræktanlegs lands, ferskvatns, né áburðar. Jafnframt framleiða þeir meiri lífmassa á skemmri tíma en landplöntur. Markmið þessa rannsóknarverkefnis var að nýta brúnþörunga sem hráefni fyrir örverur og ensím og framleiða með hjálp efnaskiptaverkfræði og erfðatækni verðmætar afurðir úr þörungasykrum. Verkefninu var skipt í fjóra hluta. (1) Thermoanaerobacterium islandicum AK17, loftfirrt hitakær baktería, var þróuð sem frumuverksmiðja fyrir framleiðslu á etanóli. (2) Með erfðabreytingum tókst að fella út efnaskiptaferla og beina flæði orku og kolefnis að etanólframleiðslu. Nýr, breyttur stofn, AM6, framleiddi etanól á skilvirkan hátt ( 95% af fræðilegu hámarki) úr mannitóli, glúkósa og fásykrum í þörungahýdrólýsati. (3) Þróuð var aðferð til að framleiða 2-Keto-3-deoxygluconate (KDG), sem er milliefni í framleiðslu ýmissa verðmætra efna, úr alginati og lamínarin sykrum með hjálp hitakærra ensíma. (4) Ofangreindir framleiðsluferlar krefjast niðurbrots viðkomandi sykra úr brúnþörungum. Í tengslum við slíka niðurbrotsferla var nýtt ensím (laminarinasi) sem brýtur niður beta-glúkön í smásykrur, tvísykrur og glúkósa, framleitt með erfðatæknilegum aðferðum og eiginleikar þess rannsakaðir. Í heild sýna niðurstöður verkefnisins að með því að beita efnaskiptaverkfræði og erfðatækni geta brúnþörungar nýst sem sjálfbært hráefni í líftækni. Þannig getur verkefnið stuðlað að innleiðingu aðferða til að draga úr notkun jarðefnaeldsneytis og þar með þróun lífhagkerfisins, og sjálfbærari framtíð.