Melanoma dedifferentiation enhances IFNγ responses and reduces cytotoxic T cell activity

Abstract

Cutaneous melanoma is a deadly skin cancer arising from epidermal melanocytes. A defining feature of melanoma cells is their ability to reversibly dedifferentiate in response to cellular stress, largely through loss of the transcription factor MITF. Dedifferentiation is associated with reduced melanocytic antigen expression, increased migratory and invasive capacity, altered responses to inflammatory stimuli, e.g. leading to increased IFNγ-induced PD-L1 expression. This indicates that melanoma dedifferentiation may influence anti-tumor immune responses and contribute to immune evasion. In this thesis, the effects of melanoma dedifferentiation on immunomodulatory gene expression and melanoma-T cell responses were investigated.

The effects of dedifferentiation on immunomodulatory gene expression were assessed by siRNA mediated knockdown of MITF expression in 624Mel cells followed by IFNγ stimulation. Transcriptomic and epigenetic effects were assessed via RNA-seq and ATAC-seq, respectively. IFNγ-induced PD-L1 expression following MITF knockdown was evaluated in 624Mel, SK-MEL-28, A357P, Malme-3M and B16 melanoma cells by qPCR and western blotting. Small molecular inhibitors against the JAK kinases, STAT3 and NFκB and siRNAs targeting STAT1 and IRF1 were used to investigate PD-L1 regulation in 624Mel cells. Public RNA-seq data from patient-derived melanoma cell lines were analyzed to validate the broader relevance of the results. Co-cultures were performed using TCR-redirected T cells and GFP expressing melanoma cell lines at varying differentiation states in live-cell imaging assays. Cytokine secretion in the co-cultures was quantified using a Luminex assay.

The results showed that dedifferentiation predisposes melanoma cells to IFNγ signaling through rearrangements in chromatin accessibility, resulting in widespread expression of immunomodulatory genes. PD-L1 expression in dedifferentiated 624Mel cells was mediated via the canonical JAK-STAT1-IRF1 pathway and accompanied by a significant increase in IRF and STAT transcription factor motif accessibility. Co-cultures of TCRredirected T cells and melanoma cell lines suggest that differentiation state does not impair antigen processing and presentation. However, the rate of cytotoxic T cell responses was reduced by IFNγ pre-treatment of either highly differentiated or undifferentiated melanoma cell lines, and by induced dedifferentiation via MITF knockdown. T cell derived secretomes following culture with undifferentiated melanoma cells contained less TNFα, Granzyme B, CXL10, MIF and CCL5 than when cultured with differentiated cells, while containing more PD-L1, IL-8, CD25 and IL-6, suggesting decreased T cell activation. In conclusion, melanoma dedifferentiation may directly mediate immunosuppression.

Sortuæxli er banvæn tegund húðkrabbameins með ríka tilhneigingu til meinvarpamyndunar. Þessi eiginleiki sortuæxla skýrist af sveigjanlegu svipfari æxlisfrumnanna, en þær geta breytt svipfari sínu til að bregðast við áskorunum í nærumhverfi sínu, t.d. súrefnisskorti eða bólgusvörum. Þessi aðlögunarhæfni tengist að stórum hluta umritunarþættinum MITF, sem stýrir sérhæfingu litfrumna. Sortuæxlisfrumur eru almennt sérhæfðar, en téðar svipfarsbreytingar fela það í sér að þær hætta að tjá MITF og verða ósérhæfðar. Rannsóknir benda til þess að ósérhæfðar sortuæxlisfrumur sýni aukna svörun við bólguboðefnum. Það getur leitt til aukinnar tjáningar ónæmismótandi gena og bendir til þess að sérhæfingarstig geti haft áhrif á ónæmissvör í sortuæxlum. Í þessu verkefni voru áhrif afsérhæfingar á ónæmismótandi genatjáningu og T frumusvar gegn sortæxlisfrumum rannsökuð.

Afsérhæfing var framkölluð í sortuæxlisfrumulínum með því að slá niður MITF með siRNA inngripum og frumurnar síðan örvaðar með IFNγ. Þetta var gert í sortuæxlisfrumulínunum 624Mel, SK-MEL-28, Malme-3M, A37P og B16. Áhrifin voru metin með RNA- og ATAC-raðgreiningu í 624Mel frumulínunni, en PD-L1 tjáning var metin með qPCR og western þrykki. Hindrum gegn JAK, STAT3 og NF-κB ásamt siRNA gegn STAT1 og IRF1 var beitt til að rannsaka hvernig PD-L1 tjáningu er stýrt í 624Mel frumum. Til að staðfesta niðurstöðurnar var notast við birt RNA-raðgreiningargögn. Fyrir samræktartilraunir var T frumum erfðabreytt til að tjá tiltekna T frumuviðtaka og þær síðan ræktaðar með GFP merktum sortuæxlisfrumum á mismunandi sérhæfingarstigum. Áhrif T frumnanna í samræktinni voru metin út frá GFP merki sortuæxlisfrumnanna með Incucyte 3S myndgreiningartæki. Seyting bólguboðefna í samræktunum var svo mæld með Luminex.

Niðurstöður verkefnisins sýna að afsérhæfing veldur umfangsmiklum breytingum á litnisskipulagi sortuæxlisfrumna sem auka aðgengi umritunarþátta að ónæmismótandi genum. Samhliða því eykst tjáning fjölmargra ónæmismótandi gena í kjölfar IFNγ örvunar. Aukin PD-L1 tjáning í afsérhæfðum frumum er stýrt af JAK-STAT1-IRF1 boðferlinum, sem bendir til aukinnar virkni IFNγ boðleiða. Samræktartilraunirnar sýndu að sérhæfingarstig hefur ekki áhrif á getu sortuæxlisfrumna til að virkja T frumur með mótefnavakabirtingu. Hins vegar voru mjög sérhæfðar eða alveg ósérhæfðar sortuæxlisfrumur viðnámsmeiri gegn T frumusvari eftir IFNγ örvun. T frumur í rækt með ósérhæfðum frumum seyttu minna magni af TNFα, Granzyme B, MIF, CXCL10 og CCL5, en meira af PD-L1, IL-6, IL-8 og CD25, sem bendir til breyttrar eða lakari virkjunar. Niðurstöður verkefnisins benda því til þess að afsérhæfing sortuæxlisfrumna hafi bein áhrif á ónæmissvar gegn sortuæxlum.