Effects of exopolysaccharides from Cyanobacterium aponinum from the Blue Lagoon in Iceland on immune responses in vitro

Abstract

Lækningamáttur Bláa Lónsins var uppgötvaður af sórasjúklingum skömmu eftir myndun þess og hafa jákvæð áhrif böðunar í lóninu verið staðfest í klínískum rannsóknum. Enn fremur hefur verið sýnt að böðun í lóninu samhliða UVB meðferð sé árangursríkari en UVB meðferð ein og sér. Þrátt fyrir vinsældir lónsins er lítið vitað um hvernig það hefur áhrif á sóra. Blágrænþörungurinn Cyanobacterium aponinum er ríkjandi lífvera í jarðsjó Bláa Lónsins og framleiðir hann utanfrumufjölsykru (EPS-Ca) sem hann seytir í umhverfi sitt. Tilgáta okkar er að EPS-Ca hafi áhrif á ónæmiskerfið sem geti tekið þátt í að miðla þeim bata sem sórasjúklingar fá við böðun í lóninu. Tilgangur verkefnisins var að kanna verkun og verkunarmáta EPS-Ca í frumum sem taka þátt í meingerð sóra. Utanfrumufjölsykran EPS-Ca var einangruð úr floti C.aponium ræktar frá Bláa Lóninu. Angafrumur, sérhæfðar út frá einkjörnungum, voru ræstar með boðefnunum IL-1β og TNF-α og inneitri (LPS) með eða án EPS-Ca í 24 tíma. CD4+ T frumur úr mönnum voru örvarðar með mótefnum gegn CD3 og CD28 í 72 tíma með eða án EPS-Ca síðasta sólarhringinn. Hyrnisfrumur, fengnar frá ATCC, voru örvaðar með TNF-α og annaðhvort IFN-γ eða IL-17A og meðhöndlaðar með eða án EPS-Ca í 24 tíma. Áhrif EPS-Ca voru metin með því að mæla styrk boðefna í floti frumna með ELISA aðferð, tjáningu innanfrumu- og yfirborðssameinda með frumuflæðisjá og lagsjármyndum, og mRNA tjáningu með rauntíma PCR. Angafrumur þroskaðar í návist EPS-Ca juku seytun þeirra á ónæmisbælandi boðefninu IL-10. Angafrumur þroskaðar í návist EPS-Ca ræstu einnig og sérhæfðu ósamgena CD4+ T frumur í samrækt í T bælifrumur (Treg) á kostnað sérhæfingar þeirra í sjúkdómshvetjandi Th17 frumna. Ennfremur tjáðu angafrumur meðhöndlaðar með EPS-Ca meira af yfirborðssameindinni CD141 en angafrumur þroskaðar án EPS-Ca. CD141 er yfirborðssameind sem hefur verið tengd bæli-angafrumum og niðurstöðurnar sýndu að CD141 jákvæðar angafrumur seyttu meira af IL-10 en angafrumur sem tjáðu ekki CD141. Hins vegar dró EPS-Ca meðhöndlun úr tjáningu angafrumna á Dectin-1 viðtakanum, bæði á mRNA (CLEC7A) og próteinformi. EPS-Ca dró einnig úr umritun á SYK sem er lykilpróteinið í boðleiðinni sem liggur frá Dectin-1 viðtakanum. CD4+ T frumur sem voru örvarðar í návist EPS-Ca seyttu minna af IL-17, IL-13 og IL-10 samanborið við CD4+ T frumur sem voru örvarðar án EPS-Ca. EPS-Ca minnkaði einnig hlutfall T frumna sem tjáðu CD69 á yfirborði sínu. EPS-Ca dró einnig úr fosfæringu á ZAP70 sem er lykilpróteinið í miðlun ræsingar inn í T frumur. Hyrnisfrumur meðhöndlaðar með EPS-Ca seyttu minna af flakkboðunum CXCL10 og CCL20 en hyrnisfrumur örvaðar án EPS-Ca. Enn fremur dró EPS-Ca meðhöndlun úr umritun SYK, CLEC7A og CAMP en CAMP er genið sem tjáir fyrir bakteríudrepandi peptíðinu LL37 sem er tjáð í yfirmagni í húð sórasjúklinga og talið eiga þátt í meingerð sjúkdómsins. Niðurstöður rannsóknarinnar sýna að EPS-Ca breytir svipgerð angafrumna í bæli-angafrumur sem stuðla að sérhæfingu T frumna yfir í T bælifrumur. Einnig dregur EPS-Ca úr boðefnaseytun og ræsingu örvaðra T frumna. EPS-Ca gæti því dregið úr ræsingu og fjölda T frumna sem halda til í húðinni. EPS-Ca minnkaði einnig seytingu hyrnisfrumna á flakkboðum sem kalla T frumur til húðarinnar og minnkaði umritun gena sem tjá fyrir próteinum sem talin eru tengjast meingerð sóra. EPS-Ca virðist því hafa áhrif á allar lykilfrumurnar sem taka þátt í meingerð sóra og virðist áhrifunum miðlað með hindrun á Dectin-1 viðtakanum og Syk boðleiðinni. Niðurstöðurnar benda því til þess að EPS-Ca geti átt þátt í þeim bata sem sórasjúklingar fá við böðun í lóninu og leiða í ljós með hvaða leiðum þeim áhrifum er mögulega miðlað.

Regular bathing in the Blue Lagoon in Iceland has been shown to have beneficial effects on the manifestations of psoriasis in clinical studies. Moreover, bathing in the Blue Lagoon in conjunction with UVB treatment gives better results than UVB treatment alone. The beneficial effects may be attributed to the unique chemical and ecological composition of the Lagoon. Our hypothesis is that an exopolysaccharide secreted by Cyanobacterium aponinum (EPS-Ca), one of the two main organisms in the Lagoon, may have specific immunomodulating effects that contribute to the therapeutic benefits obtained by regular bathing in the Lagoon. The objective of the study was to determine the effects of EPS-Ca on immune responses of cells involved in the pathogenesis of psoriasis and to elucidate how EPS-Ca mediates its effects. EPS-Ca was isolated from supernatants of cultures of C. aponinum obtained from the Blue Lagoon. Human monocyte-derived dendritic cells (DCs) were matured with interleukin (IL)-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α and lipopolysaccharides (LPS) with or without EPS-Ca for 24 h. CD4+ T cells isolated from human blood were stimulated with antibodies against CD3 and CD28 for 72 h with or without EPS-Ca for the last 24 h of the stimulation. Finally, adult primary keratinocytes, obtained from ATCC, were stimulated with TNF-α and either interferon (IFN)-γ or IL-17, with or without EPS-Ca for 24 h. Cytokine concentration in the supernatant was measured by ELISA, expression of mRNA by RT-qPCR, expression of intra- and extracellular molecules by flow cytometry and confocal imaging. DCs matured in the presence of EPS-Ca secreted more of the immunosuppressive cytokine IL-10 than DCs matured in the absence of EPS-Ca. EPS-Ca treatment also increased the capacity of the DCs to induce differentiation of T cells into T regulatory cells (Tregs) and diminished induction of the disease-inducing T helper (Th)17 cells. EPS-Ca-treated DCs expressed more CD141, a surface molecule that has been linked to regulatory DCs, than DCs stimulated without EPS-Ca. Interestingly, CD141+ DCs secreted more IL-10 than CD141- DCs. EPS-Ca treatment decreased DC expression of Dectin-1 and also decreased transcription of key genes in the Syk signaling pathway (CLEC7A and SYK). T cells stimulated in the presence of EPS-Ca secreted less IL-10, IL-13 and IL-17 and expressed less CD69 than T cells stimulated without EPS-Ca. Furthermore, EPS-Ca decreased the proportion of T cells expressing the active form of the T cell receptor signaling protein, ZAP70. EPS-Ca decreased keratinocyte secretion of CCL20 and CXCL10 and their transcription of CLEC7A, SYK and CAMP, the gene encoding for the antimicrobial peptide, LL37, that has been identified as an autoantigen in psoriasis. These results show that following an in vitro treatment with EPS-Ca, DCs switch their phenotype towards a regulatory one, which has the potential to induce differentiation of T cells into Tregs at the cost of their differentiation into the disease inducing Th17 cells. In addition, EPS-Ca reduced activation of stimulated T cells and keratinocyte production of inflammatory chemokines. Furthermore, EPS-Ca also reduced keratinocyte expression of the gene encoding for LL37, one of the autoantigens in psoriasis. Interestingly, the effects of EPS-Ca seemed to be mediated by its effects on Dectin-1 and the Syk signaling pathway in all the cell types studied. These data indicate that EPS-Ca may contribute to the beneficial effects obtained by psoriasis patients by bathing in the Blue Lagoon and suggests a possible mechanism by which EPS-Ca has its effects.