A Novel Role of the MITF-A Isoform in Maintaining Genomic Stability

Abstract

The genome of all living cells is susceptible to various intra- and extracellular events that can compromise its stability. This genomic stability is crucial for the normal function of all cells, and failure to preserve genome integrity can lead to cancer and other diseases. In the event of DNA damage, cells activate the so-called DNA Damage Response to initiate DNA repair. Replication stress can also cause genomic instability. Replication stress interrupts the DNA replication process by stalling the active replication fork. If there is prolonged replication stress, it leads to genomic instability, which can result in DNA damage, chromosomal abnormalities, and mutations. MITF is a transcription factor best known for its roles in melanocyte biology and melanoma, but its function in genome maintenance remains incompletely understood. While most studies have focused on the MITF-M isoform, the roles of other isoforms remain largely unexplored. Interestingly, many non-melanocytic cells predominantly express the MITF-A isoform. Data presented in this project show that MITFA is expressed in most tissues, including cancer tissues, and may function as a genome maintenance protein. In this study, we use the osteosarcoma cell line U2OS to uncover the non-melanocyte-specific role of MITF. We found that MITF depletion leads to TP53 accumulation, P21 expression, increased 53BP1 nuclear bodies, and high fork speed, suggesting a protective role in S phase, thus maintaining genomic stability. Differentially expressed genes upon MITF-A isoform knockdown show downregulation of genes associated with DNA replication and DNA repair. Mass spectrometry reveals that MITF-A shows increased interaction with proteins involved in DNA replication and repair, including RPA and PARP1, compared to MITF-M. Notably, data from single-molecule C-trap optical tweezer experiments show that MITF-A, but not MITF-M, stably binds RPA-coated singlestranded DNA. Replication dynamics revealed that MITF-A depletion led to an increase in replication fork speed, which is associated with reduced PARylation. Collectively, this study highlights MITF-A’s role in DNA replication and in maintaining genomic stability.

Erfðamengi allra lifandi frumna er viðkvæmt fyrir ýmsum innan- og utanfrumuatburðum sem geta haft áhrif á stöðugleika þess. Erfðafræðilegur stöðugleiki er mikilvægur fyrir eðlilega starfsemi allra frumna en tap hans getur leitt til krabbameins og annarra sjúkdóma. Við DNA skaða virkja frumur svokallaða DNA skaðaviðbrögð til að hefja DNA viðgerð. Álag við afritun DNA getur einnig valdið erfðafræðilegum óstöðugleika. Við það truflast DNA afritunarferlið þegar virki afritunargaffalinn stöðvast. Ef langvarandi afritunarálag er til staðar leiðir það til erfðafræðilegs óstöðugleika, sem getur leitt til DNA skaða, litningafrávika og stökkbreytinga. MITF er umritunarþáttur sem er þekktastur fyrir hlutverk sitt í líffræði sortufrumna og sortuæxla, en hlutverk hans í viðhaldi erfðamengisins er enn ekki ljóst. Til þessa hafa rannsóknir einkum snúist um hlutverk MITF-M ísóformsins, en hlutverk annarra ísóforma eru mun minna þekkt. Frumur aðrar en melanocytes eða sortuæxlusfrumur tjá aðallega MITF-A ísóformið. Hér sýnum við að MITF-A ísóformið er tjáð í flestum vefjum, þar á meðal krabbameinsvefjum og starfar sem viðhaldsprótein erfðamengisins. Beinkrabbameinsfrumulínan U2OS var notuð til að greina hlutverk MITF. Við komumst að því að þegar MITF er hindrað í beinkrabbameinsfrumulínunni U2OS leiðir það til uppsöfnunar TP53, tjáningar P21 og aukinnar kjarnafjölgunar 53BP1. Einnig eykur það gaffalhraðann en það bendir til verndandi hlutverks í S-fasa sem viðheldur stöðugleika erfðaefnisins. minnkar tjáning gena sem tengjast DNA afritun og DNA viðgerð. Massagreining sýnir að MITF-A binst í auknum mæli próteinum sem taka þátt í DNA afritun og viðgerð, þar á meðal RPA og PARP1, þegar borið er saman við MITF-M. Athyglisvert er að gögn úr C-gildru prófinu sýna að MITFA, en ekki MITF-M, binst stöðugt RPA-húðuðu einþátta DNA. Lækkun í styrk MITF-A leiddi til aukins gaffalhraða afritunar sem tengist minnkaðri PARýleringu. Samanlagt varpar þessi rannsókn ljósi á hlutverk MITF-A í DNA afritun og í að viðhalda stöðugleika erfðaefnisins.