The Impact of Smoothened Cholesterol-Binding Pocket Mutations on Hedgehog Signaling and Osteoarthritis

Abstract

A genome wide association study identified a risk variant of Smoothened (p.Arg173Cys; SMOR173C) associated with hip osteoarthritis. Smoothened (SMO), a 7-transmembrane G protein coupled receptor-like protein, is a key component of the hedgehog signal transduction mechanism. The hedgehog signaling pathway is known to be activated in osteoarthritic chondrocytes, but this was the first identified osteoarthritis risk variant in a hedgehog pathway gene. Interestingly, even though hedgehog signaling is elevated in osteoarthritis tissues, structural analysis predicted the SMOR173C variant to reduce the binding capability of SMO to cholesterol. The binding of cholesterol to the extracellular domain of SMO was recently discovered to be a critical step in SMO activation. As such, the predicted effect of this variant on SMO conflicts with the current known relationship between hedgehog signaling and osteoarthritis. Thus, the aim of the studies described in this thesis was to elucidate the role of the SMOR173C variant in the development of osteoarthritis. To determine whether the SMOR173C variant alters downstream hedgehog signaling activity, we introduced the mutation to the prechondrogenic cell line, ATDC5 in two ways: by overexpressing the human SMO protein containing the SMOR173C mutation, and by generating an endogenously expressing mutation by restoring a null allele in the ATDC5 Smo-null cell line. We showed in both models that the SMOR173C did not abolish downstream hedgehog signaling activity, disproving the structural predictions for the variant. Additionally, we microinjected hSMOR173C mRNA into smo-/- zebrafish embryos and showed that the hSMOR173C mRNA more efficiently recovered a normal morphological phenotype than the hSMOWT mRNA or mRNAs with mutations known to abolish cholesterol binding and downstream hedgehog signaling. To determine the effect of the SMOR173C mutation on osteoarthritis development, we developed a three-dimensional hydrogel cell culture system to better recapitulate the native environment of chondrocytes and found that in the hydrogel system the ATDC5 cells showed indications of precocious differentiation when compared to ATDC5 cell cultured in differentiation medium in a monolayer. Next, we used a cytokine cocktail to stimulate the ATDC5 cells and drive them toward an osteoarthritis-like phenotype. Then we employed both methods using the endogenous mutant ATDC5 cell lines. Cells expressing the R173C variant expressed more than three-fold elevated levels of Mmp13 mRNA at baseline. The effect increased to over four-fold elevation in response to cytokine treatment. As MMP13 is a key catabolic enzyme responsible for cartilage degradation in osteoarthritis, we concluded that chronically increased MMP13 mRNA expression could be responsible for the increased risk of hip osteoarthritis associated with the SMOR173C variant. Finally, we used evolutionary and phylogenetic analyses of smo mutations in teleost fish to identify sites predicted to cause species diversification. We paired this information with clinical reports of disease and cancer driven by SMO mutations to gain a better understanding of the genetic plasticity of SMO. We also found a gene-dose response in the transgenic smo+/- zebrafish with evidence of a heterochronic shift in hedgehog signaling-driven developmental processes: somitogenesis and chondrogenesis. From this we concluded that smo is permissive of mutations largely located outside of the transmembrane domain and likely contributed to species diversification related to jaw structure and body plan morphologies throughout evolutionary history in teleost fishes. The human clinical data follow the same trend: SMO variants associated with skeletal changes lie outside the transmembrane domain, while oncogenic SMO mutations largely occur within the transmembrane domain. This project used in vitro and in vivo models to investigate the role of the SMOR173C variant in downstream hedgehog signaling as well as an osteoarthritis-like phenotype and identified a potentially pathological increase in Mmp13 mRNA expression associated with the SMOR173C variant that likely contributes to osteoarthritis initiation and progression.

Erfðabreytileikinn p.Arg173Cys í Smoothened (SMOR173C) geninu hefur verið tengdur við aukna áhættu á slitgigt í mjöðm. SMO genið skráir fyrir himnubundnum G-próteinviðtaka sem gegnir lykilhlutverki í hedgehog boðleiðinni. Þetta var fyrsti erfðabreytileikinn í hedgehog boðleiðinni sem tengdur hefur verið við aukna áhættu á slitgigt. Hedgehog boðleiðin stjórnar meðal annars þroskun brjóskfruma og hefur verið sýnt fram á aukna virkjun boðleiðarinnar í brjóskfrumum einstaklinga með slitgigt. Greining á áhrifum SMOR173C erfðabreytileikans á byggingu próteinsins benti til að breytingin drægi úr kólesterólbindigetu SMO próteinsins, sem er nauðsynleg fyrir virkjun þess. Þetta stangast á við núverandi þekkingu okkar á hlutverki hedgehog boðleiðarinnar í slitgigt. Markmið þessara rannsóknar var því að varpa ljósi á líffræðilega virkni SMOR173C erfðabreytileikans og áhrif hans á slitgigt. Til að meta hugsanleg áhrif SMOR173C stökkbreytingarinnar á virkjun hedgehog boðleiðarinnar var notast við brjóskmyndandi ATDC5 músafrumur. Þetta var gert með því að annars vegar yfirtjá SMO genið úr mönnum með eða án stökkbreytingarinnar og hins vegar með því að framkalla SMOR173C stökkbreytinguna í erfðamengi ATDC5 frumanna. Í báðum tilvikum sýndu niðurstöðurnar að SMOR173C breytingin hindraði ekki hedgehog boðleiðina. Þessar niðurstöður benda til að breytingin hafi ekki áhrif á kólesterólbindigetu SMO. Þegar SMO mRNA var sprautað í fóstur smo-/- sebrafiska kom fram meiri leiðrétting á svipgerð fiskanna þegar SMOR173C var sprautað í fiskana en þegar villigerðar SMO mRNA eða SMO mRNA með breytingum sem vitað er að hindri kólesterólbindingu SMO var sprautað í fiskana. Til að kanna áhrif SMOR173C stökkbreytingarinnar á myndun slitgigtar voru þróaðar þrívíðar ræktunaraðstæður sem líkja eftir eðlilegu umhverfi brjóskfruma. ATDC5 frumurnar sýndu merki um snemmbæra sérhæfingu án meðhöndlunar með sérhæfingaræti. Með notkun bólguboðefna var hægt að örva frumurnar í ástand sem líkist því sem sést í brjóski einstaklinga með slitgigt. Þegar frumurnar voru ræktaðar í þrívídd og með bólguboðefnum sýndu SMOR173C frumur þrefalda aukningu í tjáningu á Mmp13 miðað við villigerð, bæði með og án örvunbólguboðefna. Þar sem MMP13 er eitt helsta niðurbrotsensím brjósks, bendir þetta til þess að aukning á tjáningu Mmp13 í SMOR173C frumum gæti verið ástæðan fyrir aukinni áhættu á slitgigt. Þróunarfræðilegri greiningu á smo stökkbreytingum í beinfiskum var beitt til að greina hvaða hneppi Smo próteinsins stuðla að tegundagreiningu. Til þess að öðlast betri innsýn í erfðafræðilegan sveigjanleika SMO gensins voru þessar niðurstöður bornar saman við greiningar á því hvaða stökkbreytingar í SMO valdi sjúkdómum og krabbameini. Jafnframt fundust áhrif genaskömmtunar á frumliða- og brjóskmyndun í arfblendnum smo+/- sebrafiskum. Af þessu má draga þá ályktun að smo genið þoli stökkbreytingar að mestu leyti utan himnuhluta próteinsins og að slíkar breytingar hafi líklega átt þátt í tegundafjölbreytileika sem tengist þróun kjálkabyggingar og líkamsformgerðar í sögu beinfiska. Klínísk gögn úr mönnum sýna svipað mynstur, þar sem SMO afbrigði sem tengjast breytingum á beinagrind eru utan himnusvæða próteinsins á meðan krabbameinstengdar stökkbreytingar eru að mestu innan himnuhlutans. Verkefnið varpar nýju ljósi á hlutverk SMOR173C stökkbreytingarinnar í hedgehog boðleiðinni og þróun slitgigtar og sýnir fram á hugsanlega skaðlega áhrif hennar vegna aukningar í Mmp13, sem gæti stuðlað að upphafi og framvindu sjúkdómsins.