The non-antibacterial mechanism of action of azithromycin and other macrolides in respiratory epithelium

Abstract

Epithelial barrier failure is a common denominator in multiple acute and chronic respiratory diseases. The respiratory epithelial barrier presents the first line of defence against infectious agents and other particulate matter; continuous exposure of epithelial cells results in molecular and phenotypic changes that evoke conditions such as inflammation, fibrosis, and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Macrolide antibiotics are known for their off-label use in treatments of chronic respiratory diseases (CRD), primarily due to their anti-inflammatory and immunomodulatory effects. Azithromycin (AZM), in particular, has been recognized for its use in decreasing the frequency of CRD exacerbations. Our research group has previously shown that AZM maintains bronchial epithelial integrity in air-liquid interface (ALI) cell culture conditions. However, the mechanisms underlying this effect are not completely known. The aim of this thesis is to understand the non-antibiotic mechanism of action of macrolides, particularly AZM, in modulation of barrier integrity and metabolism of bronchial epithelial cells. In paper I, the effects of different macrolides (AZM, clarithromycin, erythromycin, roxithromycin and solithromycin) on gene expression and epithelial integrity in ALI culture were compared. AZM treatment, when compared to other macrolides, drastically enhanced barrier integrity, induced phospholipid retention and vesicle build-up. Analysis of gene sequencing data sets revealed AZM treatment distinctly enriched several gene sets, most notably increasing the expression of genes related to keratinocyte differentiation, establishment of skin barrier and downregulation of EMT pathways. The focus of Paper II was the potential role of AZM in EMT. AZM inhibited TGF-β1-induced upregulation of SNAI1, N-cadherin and vimentin, key features of EMT. Furthermore, AZM reduced the expression of caveolin-1 that has previously been linked to EMT. The data presented in Paper II report a potential mechanism by which AZM inhibits EMT via depletion of caveolin-1 and cholesterol from the cell membrane through their transport to a perinuclear location. The aim of Paper III was to expand on and compare the effects of the same macrolide antibiotics as those examined in Paper I, but with a focus on oxidative phosphorylation and mitochondrial function. Macrolide treatment indirectly decreased mitochondrial respiration and lowered protein levels of electron transport chain proteins. However, only AZM treatment caused an increase in reactive oxygen species at 72 hours post treatment along with a downstream increase in lipid peroxidation. The antioxidant pathway of KEAP1/NRF2 was activated and gene expression data from longer treatments (14 and 21 days) in ALI culture revealed that AZM initiated mitochondrial dynamic and protective pathways through mitohormesis. In Paper IV, AZM was compared to a nonantibacterial derivative of AZM (EP395) to determine whether the effects of AZM are distinct from its antimicrobial activity. It was shown that EP395 retained the barrier integrity enhancing capabilities of AZM along with positive enrichment of the same gene sets found to be uniquely affected by AZM treatment, indicating that these effects are distinct from the antibacterial activity. Papers V and VI focused on ventilatorinduced lung injury (VILI) in a rodent model where it was investigated whether macrolides ameliorate the negative effects caused by mechanical ventilation. It was shown that barrier failure correlated with increased expression of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and higher tidal volumes. Furthermore, increased oxidative stress and phenotypic changes in mitochondria were observed. Finally, we reported that AZM and EP317, another derivative of AZM with reduced antibacterial activity, ameliorated pulmonary oedema, enhanced barrier integrity, and attenuated inflammatory responses caused by ventilation. Collectively, I have shown that AZM has greater effects on bronchial epithelial barrier integrity than other macrolides, that it inhibits EMT and fortifies mitochondrial resilience. I propose possible mechanistic pathways involved in the beneficial effects of AZM treatment, while recognising that additional research is needed to fully uncover AZM’s involvement in the discussed pathways.

Öndunarfæraþekjan er fyrsta varnarlínan gegn sýklum og utanaðkomandi efnum. Stöðugt áreiti á þekjufrumur gagnvart skaðlegum þáttum í umhverfinu orsakar breytingar á viðbrögðum fruma og svipgerð þeirra sem leitt getur til ástands líkt og þekjubrests, bólgu, trefjunar og bandvefsumbreytingar þekjuvefs (e. epithelial to mesenchymal transition, EMT). Þekjubrestur kemur fyrir í fjölda bráðra og langvarandi öndunarfærasjúkdóma og skortur er á meðferðarúræðum sem styrkja þekjuvarnir. Makrólíðar eru sýklalyf sem hafa verið nýtt í auknum mæli vegna áhrifa sem ekki tengjast sýkladrepandi notkun þeirra. Makrólíðar búa yfir bólguhamlandi eiginleikum og eru þess vegna nýttir í meðferðir við langvinnum öndunarfærasjúkdómum (e. Chronic respiratory diseases, CRD). Azithormycin (AZM) er 15-liða makrólíði sem dregur úr sjúkdómsmynd í CRD. Rannsóknarhópur okkar hefur áður sýnt fram á að AZM styrki og viðhaldi heilleika öndunarfæraþekju í frumuræktun við loft-vökva skils (e. air-liquid interface/ALI) aðstæður. Verkunarhættir AZM í þekjustyrkingu eru enn að stórum hluta óþekktir. Markmið þessa doktorsverkefnis var að efla þekkingu og auka skilning á verkunarháttum AZM og annara makrólíða, utan sýklalyfjaverkunar, þar sem áhersla var sett á rannsóknir á þekjustyrkingu og hvatberavirkni. Í verkefninu var unnið að mestu með VA10 sem er berkjuþekjufrumulína með grunnfrumueiginleika sem gerir það verkum að hún getur myndað berkjulíka þekju í ALI rækt. Í grein I bar ég saman áhrif nokkurra makrólíða á genatjáningu og þekjustyrkingu VA10 í ALI rækt. Meðferð með AZM jók þekjustyrk VA10 töluvert umfram aðra makrólíða, ýtti undir uppsöfnun fosfórlípíða og innanfrumu blöðrunga. Greining á genatjáningu í VA10 frumum meðhöndluðum með AZM sýndi aukna tjáningu á genasöfnum tengdum sérhæfingu hyrnisfruma og tilurð húðþekjutálma. Allir makrólíðarnir höfðu bælandi áhrif á EMT ferla. Í grein II fjallaði ég um bælingaráhrif AZM á EMT. Ég sýndi að AZM lágmarkaði TGF-β1 framkallaða hækkun á EMT kennipróteinunum snail1, N-cadherin og vimentin. Einnig lækkaði AZM meðferð tjáningu á caveolin-1, próteini sem tengist EMT. Við teljum að AZM hindri EMT með því að ýta undir flutning caveolin-1 og kólesteróls frá frumuhimnunni, til innanfrumu blöðrunga umhverfis kjarna. Grein III snerist um að bera saman áhrif makrólíða, þeirra sömu og notaðir voru í grein I, en nú á oxunarfosfórun og hvatberavirkni. Makrólíðarnir drógu úr hvatberaöndun og drógu úr tjáningu próteina öndunarkeðjunnar. AZM var hins vegar eina meðferðin sem olli hækkun á virkum súrefnissamböndum (ROS) 72 klukkustundum eftir meðferð og í kjölfarið peroxun lípíða. Andoxunar boðferli KEAP1/NRF2 var virkt og genatjáning í lengri ALI ræktum sýndi að AZM meðferð, í gegnum aðlögunarhæf tvífasa viðbrögð við oxunarálagi (e. mitohormetic), ýtti undir boðferla sem styrkja heilbrigði hvatbera. Í grein IV var þekjustyrkjandi virkni AZM borin saman við nýja lyfjaafleiðu af AZM með skertum bakteríudrepandi áhrifum (EP395). EP395 sýndi samskonar áhrif og AZM á þekjustyrkingu, sem og að sýna svipuð áhrif á genatjáningu. Greinar V og VI fjalla um lungnaskaða tengdan öndunarvélum og könnun á því hvort makrólíðar geti stemmt stigu við áhrifum hans. Við sýndum að þekjubresti fylgdi aukning á IL-6 tjáningu samhliða hækkaðri andrýmd. Einnig sást aukið oxunarálag og breytt svipgerð hvatbera í kjölfar öndunarvélarmeðferðar. Að lokum sýndum við fram á að AZM og EP317 (önnur afleiða af AZM með skertum bakteríudrepandi áhrifum) dragi úr lungnabjúg og bólgusvari af völdum öndunarvélarmeðferðar, en auki einnig þekjustyrkingu. Samantekið hef ég sýnt að AZM hefur umtalsvert meiri áhrif en aðrir makrólíðar á þéttni og styrkleika öndunarfæraþekju, hindri EMT og bæti heilbrigði hvatbera. Auk þess sýni ég fram á verkunarhætti sem líklega taka þátt í jákvæðum útkomum AZM meðferðar. Samt sem áður er töluverð vinna eftir, kafa þarf dýpra í þessar boðleiðir og verkunarhætti til að útskýra að fullu þáttöku AZM í þeim.