Role of Mitf in melanocyte development as determined by a conditional hypomorphic mutation

Abstract

Establishment of melanocytes, the pigment-producing cells, starts from the multipotent neural crest cells. Melanoblasts, the melanocyte precursor cells, follow a tight schedule during their development requiring proliferation, migration, and invasion of the epidermis before they form the pigment producing melanocytes. In the mouse, most melanocytes localize to the hair bulb where they deliver melanin to the hair, which gives mice their coat color. As melanocyte development is complex, this process involves many regulatory proteins and transcription factors. Microphthalmia-associated Transcription Factor (Mitf) is required for proliferation, survival and migration during the formation of melanocytes, and has therefore been suggested as the key regulator of their development. The role of Mitf has been largely studied in melanoma cells, but little is known about its role in the generation of the melanocytes. In mice, mutations in Mitf lead in most cases to the absence of melanocytes, making it difficult to observe melanoblasts during the development in vivo. We have generated an inducible mutation in MITF in the mouse by changing lysine in position 243 into an arginine. We induced this mutation in melanocytes resulting in mice with alternating areas of black, grey and white areas. This means that despite the MitfK243R mutation, some melanocytes have grown, migrated and differentiated, while others did not (hypomorphic phenotype), displaying heterogeneity for the fate of melanocytes during development upon the MitfK243R mutation. We found that in these mice, fewer melanoblasts develop and they are not able to invade the epidermis to reach the hair follicle. We generated melanocyte primary cell lines from the mice and used those to perform in vitro studies. The results revealed that upon activation of the MitfK243R mutation, the cells exhibited reduced proliferation and survival. RNAseq analysis revealed genes that are differentially regulated by MITF upon induction of the MitfK243R mutation that might explain how this conditional mutation dysregulates the development of melanocytes.

Litfrumur eru meðal frumugerða sem eiga uppruna sinn í taugakambi snemma í þroskun hryggdýra. Forverafrumur litfruma, sem nefnast melanoblast-frumur, myndast í taugakambi en fjölga sér áður en þær ferðast til að þekja allt yfirborð húðarinnar. Þessar frumur fara inn í þekju húðarinnar áður en hinar eiginlegu litfrumur verða til og hefja myndun litarefnis. Í músum enda flestar litfrumur í hársekknum þar sem þær flytja litarefni í hárið. Þetta flókna ferli kallar á ýmis stjórnprótein og umritunarþætti. Einn mikilvægasti umritunarþátturinn í litfrumum er MITF eða Microphthalmia-associated Transcription Factor en hann er nauðsynlegur fyrir frumufjölgun, lifun og frumufar í myndun litfruma. Hlutverk Mitf hefur einkum verið rannsakað í sortuæxlisfrumum en þótt þær eigi uppruna sinn í litfrumum hafa frumurnar breyst við æxlismyndunina og því ekki ljóst að hið sama eigi við í litfrumunum eða forverum þeirra. Stökkbreytingar í Mitf geni músa leiða oftast til þess að litfrumurnar og forvera þeirra vantar alveg og því hefur reynst erfitt að skilgreina in vivo hlutverk gensins í hinum ýmsu skrefum litfrumuþroskunar. Hér lýsum við skilyrtri stökkbreytingu í Mitf geni músar þar sem táknanum fyrir amínósýru 243 er breytt úr lýsin í arginín. Þegar þessi breyting var kölluð fram í litfrumum urðu einungis til mýs með mislit svæði þar sem skiptust á svört, grá og hvít svæði. Þrátt fyrir MitfK243R stökkbreytinguna hafa einhverjar starfhæfar litfrumur orðið til (svört svæði), einhverjar eru vanstarfhæfar (grá svæði) og enn aðrar eru óstarfhæfar eða vantar alveg (hvít svæði). Með því að rekja litfrumurnar í þroskun sýndum við að mun færri litfrumur verða til og íferð þeirra inn í þekjuna gerist sjaldnar. Frumulínur voru útbúnar úr litfrumum músanna og notaðar til að skoða áhrif stökkbreytingarinnar in vitro. Niðurstöðurnar sýna að þegar MitfK243R stökkbreytingin er virkjuð í frumulínunum fækkar frumuskiptingum og lifun frumanna minnkar. Raðgreining RNA sameinda sýndi að stökkbreytingin hefur sértæk áhrif á tjáningu markgena og að þau áhrif útskýra að hluta áhrif stökkbreytingarinnar á þroskun litfruma.