Epigenetic machinery (EM) factors are essential for modulating chromatin states and regulating gene expression. The Mendelian disorders of the epigenetic machinery (MDEM), caused by the mutations in the EM, often result in shared phenotypes, including intellectual disability and growth dysregulation. Many individuals with an MDEM diagnosis exhibit DNA methylation (DNAm) abnormalities in peripheral blood cells. However, whether DNAm dysregulation in MDEMs functionally links these two overlapping phenotypes remains unclear. In this thesis, we aim to identify potentially functionally important DNAm loci that show changes across multiple EM deficient neuronal models.
We utilized CRISPR-Cas9 technology to individually knockout (KO) 46 EM genes in a disease relevant cell type, murine neuronal progenitor cells (mNPCs). We then assessed the whole-genome DNAm signatures via Oxford Nanopore Technology (ONT) sequencing. In parallel, we established a neuronal developmental model and observed some DNAm alterations during neuronal maturation. In this study, we observed extensive global demethylation in Dnmt1KOs, whereas Kmt2aKOs exhibited relatively mild DNAm changes. Despite the limited overlap in differentially methylated regions (DMRs) in cells with these two KOs, we uncovered a substantial overlap in differentially expressed genes (DEGs), with a strong positive correlation between the shared DEGs. These shared DEGs were enriched in pathways associated with neuronal development and transcripts involved in exit from the cell cycle, aligning with the increased number of TUBB3+ neurons in both KOs. In Dnmt1KOs, DMRs were significantly enriched in binding sites for key transcription factors (TFs), including EGR1, SP1, and MYC. The targets of these TFs also showed differential expression, suggesting a functional interplay between Dnmt1-mediated DNAm and TF activity. This highlights a potential crosstalk between DNMT1 and TFs in regulating gene expression in mNPCs.
Beyond individual KO analyses, we systematically investigated DNAm patterns across all 46 EM-KOs. While most exhibited subtle DNAm alterations, notable exceptions such as Dnmt1 and Dnmt3b, showed more sizable DNAm changes. We identified 108 putative DMRs across 46 EM-KOs, with enrichment in promoter regions, suggesting a role for EMs in modulating promoter DNAm states. We therefore leveraged non-negative matrix factorization (NMF) to systematically cluster EM based on their DNAm profiles in promoters of protein coding genes, yielding 3 distinct EM clusters. Although a subset of EMs in each cluster exhibited disrupted neuronal maturation rates, these phenotypic changes did not entirely align with EM classification. Leveraging our experimental setup using cells derived from an F1 hybrid model (B6J paternal × FVB/NJ maternal), we identified allele-specific differentially methylated regions (AS-DMRs) using single nucleotide polymorphisms (SNPs). In control samples, we detected 1,074 AS-DMRs, some of which were disrupted in EM-KOs. Finally, phasing analysis revealed a single genome-wide significant DMR located in the 3´UTR of Zic4, which was differentially expressed during neuronal maturation. Functional validation via Zic4 knockdown experiments demonstrated impaired neuronal maturation, underscoring the potential role of Zic4 in EM-related neurodevelopmental processes.
Our studies provide a valuable strategy of integrating ONT and RNA sequencing to investigate DNAm dynamics and gene expression changes in a disease relevant model (neurons). This integrative approach enables the detection of subtle but biologically meaningful candidates that may serve as therapeutic targets or diagnostic markers for MDEMs.
Utangenaerfðaþættir (e. epigenetic machinery, EM) gegna mikilvægu hlutverki við að stjórna aðgengi litnis og hafa þannig áhrif á genatjáningu. Mendelsk heilkenni utangenakerfisins (e. Mendelian disorders of the epigenetic machinery, MDEM) orsakast vegna stökkbreytinga í EM genum og hafa mörg þeirra sameiginlegar svipgerðir, þar á meðal greindarskerðingu og vaxtartruflanir. Margir einstaklingar með MDEM greiningu sýna frávik í DNA metýlun (DNAm) í blóðsýnum. Hins vegar er óljóst hvort truflun á DNAm sé orsök fyrir sameiginlegum svipgerðum þessara heilkenna. Í þessari ritgerð skoðum við truflun í DNAm í taugafrumum með útslátt á mörgum mismunandi EM þáttum til að reyna að skilgreina mikilvæg svæði sem eru undir stjórn utangenaerfða og gegna hlutverki í taugaþroska.
Í þessu verkefni notuðum við CRISPR-Cas9 tækni til að slá út (e. knock out, KO) 46 EM gen, hvert fyrir sig, í músaforverataugafrumum (e. Mouse Neural Progenitor Cells, mNPC), frumutegund sem tengist algengri MDEM svipgerð, þroskaskerðingu. Við mældum síðan áhrif þessa útsláttar á DNAm með Oxford Nanopore Technology (ONT) raðgreiningu. Samhliða bjuggum við til taugafrumuþroskalíkan og rannsökuðum breytingar á DNAm við þroska taugafrumna.
Í þessari rannsókn sáum við töluverðar breytingar á DNAm í frumum með útslátt á DNMT1 (Dnmt1KOs), en minni breytingar í frumum með útslátt á KMT2A (Kmt2aKOs). Þrátt fyrir takmarkaða skörun á svæðum með breytta metýlun (e. differentially methylated regions, DMR) í þessum tveimur útsláttarmódelum (KOs), afhjúpuðum við töluvert meiri skörun á mis-tjáðum genum (DEG), og flest þeirra sýndu breytingar í sömu átt. Þessi sameiginlegu mistjáðu gen innihéldu mikið af genum sem tengjast þroskun taugafrumna og sýndu brottför úr frumuhringnum, sem samræmist auknum fjölda TUBB3+ taugafrumna í báðum KO módelum. Í Dnmt1KOs sýndu DMR marktæka aukningu á bindisetum fyrir lykil umritunarþætti (e. transcription factors, TFs), þar á meðal Egr1, Sp1 og Myc. Markgen þessara TFs sýndu einnig breytta tjáningu í Dnmt1KOs, sem bendir til samspils milli Dnmt1 miðlaðs DNAm og TF virkni. Þetta bendir til mögulegs samspils milli DNMT1 og TFs við að stjórna tjáningu gena í mNPCs.
Við rannsökuðum einnig DNAm mynstur á kerfisbundinn hátt í öllum 46 EM-KOs. Þó að tap á flestum slíkum EM genum leiddi almennt til vægra DNAm breytinga, voru undantekningar á því eins og til dæmis útsláttur á Dnmt1 og Dnmt3b sem sýndu mun meiri breytingar á DNAm. Við greindum 108 hugsanleg DMR meðal 46 EM-KO, sem virtust sérstaklega algeng í í stýrlum gena, sem bendir til þess að EM séu þátttakendur í mótun DNAm á stýrilsvæðum. Við nýttum tölfræðilega aðferðafræði (e. non-negative matrix factorization, NMF) til flokka EM gen á kerfisbundinn hátt byggt á DNAm í stýrlum próteinkóðandi gena, sem leiddi í ljós þrjá aðskilda EM hópa. Þrátt fyrir að hópur EM í hverjum klasa sýndi truflun í þroska taugafrumna, voru þessar svipgerðarbreytingar ekki algjörlega í takt við EM klasana. Með því að nýta tilraunauppsetningu okkar, þar sem frumur voru fengnar úr F1 blendingslíkani tveggja músa-arfgerða (B6J faðir × FVB/NJ móðir), greindum við samsætusértæk mis-metýleruð svæði (e. Allele-Specific DMRs, AS-DMRs) með því að nýta einkirnabreytileika (e. single nucleotide polymorphisms, SNPs) milli arfgerðanna til að aðgreina samsæturnar. Í samanburðarsýnum fundum við 1.074 AS-DMRs, þar sem sum þeirra voru trufluð í EM-KOs. Að lokum leiddi fasagreiningin í ljós eitt marktækt erfðamengis-breytt DMR, staðsett í 3´UTR á Zic4 geninu, sem einnig sýndi breytingu í genatjáningu við þroska taugafrumna. Með því að nota Zic4 þöggun sýndum við fram á skertan taugaþroska, sem bendir til mögulegs hlutverks Zic4 í EM-tengdum taugaþroskaröskunum.
Rannsóknir okkar sýna mikilvægi þess að samþætta ONT og RNA raðgreiningu til að rannsaka DNAm breytileika og breytingar á genatjáningu í viðeigandi sjúkdómalíkani (taugafrumum). Þessi samþætta nálgun gerir kleift að greina smávægilegar, en líffræðilega þýðingarmikla breytileika sem gætu nýst sem lyfjamörk eða greiningarmerki fyrir þessa MDEM sjúkdóma.
Læst til 30.12.2030