Epitranscriptomics refers to post-transcriptional regulation of gene expression via RNA modifications, which can affect the function and structure of RNAs but do not entail any changes to the ribonucleotide sequence. RNA modifications are found on all forms of RNA including messenger RNA (mRNA) with methylations being the most common forms of mRNA modifications. Two such mRNA methylations are N6-methyladenosine (m6A) and N1-methyladenosine (m1A) which are known to be reversible. Studies have demonstrated that mRNA methylations are involved in and influence numerous biological processes including the DNA damage response. The DNA damage response is vital for the maintenance of genomic integrity and cell survival. DNA double strand breaks (DSB) are thought the most cytotoxic form of DNA damage as unrepaired or incorrectly repaired DSBs can result in cell death or lead to increased genomic instability and increase risk of cancer development. The ability to detect and correctly repair DNA DSB is vital for cells to maintain genome stability and to transfer correct genetic information from one generation to the next.
ALKBH3 and FTO (ALKBH9) are dioxygenases belonging to the AlkB protein family. ALKBH3 has a well-established role in DNA alkylation repair but can also act as an mRNA demethylase, a function shared with other members of the AlkB family. Specifically, ALKBH3 removes m1A from mRNA, whereas FTO is primarily recognized for demethylating m6A from mRNA. In a previously published article, the Sigurdsson laboratory revealed that ALKBH3 is promoter hyper-methylated in ~20% of breast cancers. This form of epigenetic regulation reduced ALKBH3 expression and was correlated with reduced survival. Exploring the function of silencing ALKBH3 and other members of the AlkB family revealed that knockdown of ALKBH3 and FTO caused protein downregulation of RNF168, a pivotal protein in DNA DSB repair.
The first aim of this project involved elucidating the regulatory role ALKBH3 and FTO have on RNF168. Further exploration into silencing ALKBH3 and FTO revealed that loss of ALKBH3 and FTO lead to increased m1A and m6A methylation marks on the RNF168 transcript, resulting in impaired mRNA export and decreased protein expression. These results point towards a novel form of epitranscriptomic regulation of RNF168.
The secondary aim of this project was to explore the potential influence of ALKBH3 and FTO on the DNA DSB response, attributed to their regulation of RNF168. Cells depleted of ALKBH3 and FTO demonstrate strong signs of RNF168 dysfunction, including impaired 53BP1 recruitment to DNA DSB and altered DNA DSB repair dynamics. Subsequent investigations revealed heightened genome instability and increased sensitivity to genotoxic agents upon the loss of ALKBH3 and FTO.
The findings presented in this thesis present a novel regulatory mechanism for RNF168 and unveil the involvement of mRNA modification in DNA DSB repair signaling. Furthermore, providing evidence of interplay between alkylation repair and DNA DSB repair. The removal of mRNA modification from the DNA repair factor RNF168, presents a new regulatory mechanism into the DNA DSB repair signaling, making it a unique addition to the rapidly evolving field of epitranscriptomics. The fact that demethylases play a part in genomic maintenance and cell survival in response to genotoxic agents is likely to have impact on the DNA repair field and could prove to be a vital factor to cancer development. Lack of ALKBH3 and FTO might be used as a potential marker for cancer treatment response due to both lack of alkylation repair and possibly because of DNA double strand repair deficiency, highlighting the possible clinical benefits of this project.
RNA sviperfðir vísa til stjórnunar á genatjáningu eftir umritun með breytingum á RNA sem geta haft áhrif á virkni og uppbyggingu RNA sameindarinnar án þessa að valda breytingum í ríbósakjarnsýru röðinni. RNA breytingar finnast á öllum gerðum RNA þar á meðal mRNA þar sem metýleringar eru eitt algengasta form breytinga. Tvær af þekktustu mRNA metýleringunum eru N6-metýladenósín (m6A) og N1-metýladenósín (m1A) en báðar breytingarnar eru afturkræfar. Rannsóknir hafa sýnt fram á að mRNA metýleringar taka þátt í og hafa áhrif á marga líffræðilega ferla, þar á meðal DNA skemmdarviðbragði í frumum. Viðbrögð frumna við DNA skemmdum eru mikilvæg fyrir lífvænleika þeirra og til að viðhalda stöðugleika erfðamengisins. DNA tvíþáttabrot (DTB) eru talin alvarlegasta gerð af DNA skemmdum þar sem galli í viðgerðum á DTB getur leitt til frumudauða og stuðlað að krabbameinsmyndun. Hæfni frumna að greina og gera við DNA DTB á réttan hátt er nauðsynleg til að frumur haldi erfðafræðilegum stöðugleika og til að flytja réttar erfðaupplýsingar frá einni kynslóð til annarrar.
ALKBH3 og FTO (ALKBH9) eru díoxýgenasr sem tilheyra AlkB prótínfjölskyldunni. ALKBH3 hefur vel skilgreint hlutverk í viðgerðum á alkýlerandi DNA skemmdum en er einnig þekkt fyrir að starfa sem mRNA demtýlasi ásamt örðum meðlimum í AlkB prótín fjölskylunni. Nánar tekið, þá fjarlægir ALKBH3 m1A af mRNA og FTO er þekktast fyrir að fjarlægja m6A af mRNA. Fyrri rannsóknir frá Rannsóknarstofu í krabbameinsfræðum hafa sýnt að stýrilsvæði ALKBH3 er metýlerað í ~20% af brjóstakrabbameinum. Þessi sviperfðastjórnun leiðir til minni ALKBH3 tjáningar og verri lifunar hjá brjóstakrabbameins sjúklingum. Frekari rannsóknir á ALKBH3 og öðrum AlkB prótín meðlimum leiddu í ljóst að þöggun á ALKBH3 og FTO (ALKBH9), leiddi til taps á prótíntjáningu RNF168, lykilpróteini sem tekur þátt í viðgerð á DTB.
Fyrsta markmið þessa verkefnis var að skilgreina stjórnunarhlutverk ALKBH3 og FTO á prótíntjáningu RNF168. Í ljós kom að tap á ALKBH3 og FTO leiddi til aukinna m1A og m6A metýleringarmerkja á umriti RNF168 sem leiðir til skerts mRNA útflutnings og tapi á prótíntjáningu. Bentu þessar niðurstöður til þess að ALKBH3 og FTO gætu stjórnað RNF168 í gengum RNA sviperfðir, ný leið í stjórnun á RNF168 prótín tjáningu.
Seinna markmið verkefnisins fólst í að kanna möguleg áhrif ALKBH3 og FTO á DNA skemmdarviðbragð frumna, sem rekja má til stjórnunar þeirra á RNF168. Genaþöggun á ALKBH3 og FTO leiddi í ljós að frumur sem skortir ALKBH3 eða FTO sýndu sterk merki um truflun á starfsemi RNF168, þar á meðal að 53BP1 prótínið kom ekki lengur að DNA DTB. Frekari rannsóknir sýndu fram á að frumur með skerta ALKBH3 og FTO virkni höfðu skerta getu til að gera við DTB. Einnig kom í ljós aukinn erfðafræðilegur óstöðugleiki og aukið varnarleysi fyrir lyfjum sem valda DNA skemmdum við tap á ALKBH3 og FTO.
Þessar niðurstöður benda til nýrrar gerðar stjórnunar á RNF168 og sýna þátttöku mRNA breytinga í að hafa áhrif á DNA DTB viðgerðarsvörun. Enn fremur, gefa niðurstöðurnar úr þessu verkefni vísbendingar um samspil alkýleringarviðgerðar og DNA DTB viðgerðar. Það að fjarlæga mRNA metýleringar hafi áhrif á DNA skemmdarviðbragðið er ný viðbót við ört stækkandi heim RNA sviperfða og mun einnig hafa þýðingu fyrir rannsóknir á DNA viðgerðum. Einnig að demetýlasar hafi hlutverk í að viðhalda stöðugleika erfðamengisins og svörun frumna við krabbameinslyfjum gæti reynst mikilvæg fyrir þróun krabbameins. Tap á ALKBH3 og FTO gæti verið notað sem hugsanleg vísbending fyrir svörun við krabbameinsmeðferð, bæði vegna skorts á alkýlerunarviðgerð og hugsanlega vegna skorts á DNA tvíþáttabrotum sem undirstrikar mögulegan klínískan ávinning af þessu verkefni.
