Wiedemann-Steiner heilkenni (WDSTS) er sjaldgæfur erfðasjúkdómur sem veldur greindarskerðingu sem enn reynist ólæknandi og lítið er vitað um sjúkdómsmyndun þess. Orsakir WDSTS eru arfblendnar stökkbreytingar í geni sem táknar fyrir ensíminu lysín-histónumetýltransferasa 2A (KMT2A). KMT2A er hluti af umframerfðakerfinu og sér um að bæta við metýlhóp á lysín amínósýru 4 á histónuhala H3 histónupróteinsins og þannig stýra genatjáningu. Birtingarmynd WDSTS felur í sér margvísleg líkamleg einkenni, t.d. vaxtarskerðingu, vöðvaslappleika, meltingarfæravandamál, afbriðgilega andlitsdrætti og aukinn hárvöxt. Hegðunar- og taugakerfisvandamál eru einnig algeng hjá einstaklingum með WDSTS, líkt og greindarskerðing, þroskaskerðing og aukin árásargirni. Markmið þessarar doktorsritgerðar var að dýpka skilning okkar á sjúkdómsmyndun WDSTS með ýmsum aðferðum og auka þannig þekkingu á þessu sjaldgæfa heilkenni. Auk þess rannsökuðum við mótanleika taugasvipgerðar WDSTS fósturstigi til þess að meta möguleika á þróun meðferða við heilkenninu í framtíðinni.
Í fyrsta lagi notuðum við lífupplýsingafræðilegar aðferðir til þess að skoða áhrif mislestursbreytinga í KMT2A geninu. Við bárum saman dreifingu mislestursbreytinga í KMT2A sem valda WDSTS og þeirra sem finnst í heilbrigðu þýði og valda ekki WDSTS. Við greindum mikla aukningu mislestursbreytinga í CXXC hneppinu í einstaklingum með WDSTS en hneppi þetta sér um DNA bindingu KMT2A. Hinsvegar fundum við enga aukningu á mistlestursbreytingum í SET hneppinu sem sér um ensím virkni próteinsins. Þessar niðurstöður benda til þess að CXXC hneppið sinni mikilvægu hlutverki í sjúkdómsmyndun WDSTS. Næst nýttum við okkur gervigreindartólið AlphaFold2 (AF2) í bland við tilraunaþekkingu okkar til þess að búa til tölvulíkan af ensíminu. Þetta tölvulíkan gerði okkur kleift að spá fyrir um áhrif allra mögulegra mislestursstökkbreytinga á byggingu CXXC hneppisins í KMT2A próteininu, þ.e. hvort hún væri líkleg til þess að valda heilkenninu eða ekki. Þessi aðferð gæti því nýst í framtíðinni í klínískri vinnu við greiningu á því hvort KMT2A stökkbreytingar eru líklegar til að valda WDSTS.
Í öðru lagi þróuðum við nýtt músamódel fyrir WDSTS sem kallast Kmt2a+/LSL. Við nýttum okkur margvíslegar aðferðir til að greina áhrif breytingarinnar á svipgerð músanna eins og hegðunarpróf, vefjafræðilegar litanir, kjarnsýrumögnun (PCR), RT- qPCR, tölvusneiðmyndir og heilraðgreiningu erfðamengis. Við sýndum fram á að borið saman við villigerð úr sama goti sýndi Kmt2a+/LSL músamódelið lykil-svipgerðir WDSTS heilkennisins og er því gott líkan fyrir WDSTS í mönnum. Þetta gerir músamódelið að mikilvægu tóli fyrir rannsóknir á WDSTS. Auk þess sýna Kmt2a+/LSL mýsnar aukinn hárvöxt og hvítan kviðlægan blett í feldi sem gæti mögulega tengt KMT2A við áður óþekkt hlutverk í hárvexti og taugakambsþróun. Til þess að rannsaka sjúkdómsmyndun WDSTS betur í frumum framkvæmdum við RNA raðgreiningu og CUT&Run greiningu á H3K4me1 umframerfðamerkinu í músa taugaforverafrumum (mNPC). Við greindum vanstjórnun í genatjáningu og aukið aðgengi litnis í Kmt2a+/LSL taugaforverafrumum.
Að lokum var mótanleiki taugasvipgerðar WDSTS músa rannsakað með því að notast við nestin-Cre músamódel. Með þeirri nálgun gátum við endurheimt við fulla tjáningu Kmt2a gensins um miðja meðgöngu í Nes-Cre+/-Kmt2a+/LSL músunum. Með áðurnefndum svipgerðargreiningaraðferðum sýndum við fram á að taugaforverafrumur Nes-Cre+/-Kmt2a+/LSL músanna höfðu leiðrétt afbrigðileikana í genatjáningu og endurheimt jafnvægi í umframerfðakerfinu. Við sýndum einnig fram á að Nes-Cre+/- Kmt2a+/LSL mýsnar leiðrétta þær taugasvipgerðir sem lýst var í Kmt2a+/LSL músunum. Niðurstöður þessar sýna mótanleika taugasvipgerðarinnar í WDSTS músum á meðgöngu.
Þegar á heildina er litið auka niðurstöður þessarar doktorsritgerðar skilning okkar á WDSTS. Við kynnum nýjar niðurstöður sem sýna fram á hlutverk CXXC hneppisins í sjúkdómsmyndun WDSTS auk þess að varpa ljósi á áður óþekkt hlutverk KMT2A í taugakambsþróun. Okkur tókst að búa til nýtt músamódel fyrir WDSTS og lýsa því í smáatriðum ásamt því að sýna fram á mótanleika taugasvipgerðar músamódelsins á fósturstigi. Fyrir vikið ætti að vera fýsilegt að þróa meðferðarúrræði við WDSTS í framtíðinni.
Wiedemann-Steiner syndrome (WDSTS) is a rare genetic cause of intellectual disability, with no cure and little research on the disease mechanism to this date. WDSTS is caused by heterozygous variants in a gene encoding the epigenetic regulator lysine- histone methyltransferase 2A (KMT2A). Individuals with WDSTS present with a range of symptoms widely affecting the body such as growth retardation, hypotonia, GI symptoms, distinct craniofacial features and hypertrichosis. Within the nervous system, individuals with WDSTS most commonly present with intellectual disability, developmental delay and aggressive behavior, which can prove difficult to manage and impacts their quality of life. In this PhD thesis, we aimed to gain a deeper understanding of the underlying disease mechanism of Wiedemann-Steiner syndrome (WDSTS) using several different methods and to expand on the current knowledge of this rare syndrome. Furthermore, we investigated the in utero malleability of the WDSTS neurological phenotypes in a mouse model, advancing the potential of future therapeutics for the syndrome.
First, using bioinformatic approaches, we wanted to explore the distribution of WDSTS-associated missense variants (MVs) in KMT2A. We identified the DNA binding CXXC domain of KMT2A to be highly enriched for WDSTS causing MVs using a comparative spatial analysis of MVs found in healthy populations and individuals with WDSTS. We found no evidence of MV enrichment in the enzymatic SET domain. These results suggest a novel, non-enzymatic and central role for the CXXC domain in the WDSTS pathogenesis. Utilizing the new AI-based protein prediction software AlphaFold2 (AF2) and prior experimental knowledge, we performed an in silico saturation mutagenesis of all potential MVs found within the CXXC domain of KMT2A. This allowed us to classify any future MVs as likely pathogenic or not, providing a new approach to determine the pathogenicity of a variant within the clinic.
Second, we established a novel disease mouse model of WDSTS termed Kmt2a+/LSL. We utilized various methods to characterize the mice in detail such as behavior testing, histology staining, PCRs, RT-qPCRs, CT scanning and Genome-wide long-read sequencing. We successfully demonstrated that the Kmt2a+/LSL model displays key WDSTS phenotypes compared to their wildtype littermates, and adequately represents the human WDSTS disease, making it a valuable model for any future WDSTS studies. Additionally, we provided evidence of hypertrichosis and a white abdominal spot present in our Kmt2a+/LSL model, potentially linking KMT2A to novel roles in hair growth and neural crest development. To further explore the mechanistic basis of WDSTS on a cellular level, we performed RNA sequencing and a CUT&Run of the H3K4me1 mark of mouse neuronal progenitor cells (mNPCs). We uncovered gene expression dysregulation and increased chromatin accessibility of the Kmt2a+/LSL mutant mNPCs.
Finally, we tested the malleability of neurological dysfunction using a nestin-Cre model, crossing the mouse strain with our Kmt2a+/LSL mice after validating its functionality. Using this approach, we restored Kmt2a expression around mid-gestation in the Nes-Cre+/-Kmt2a+/LSL mice. With the phenotyping methods described above, we provide robust evidence that the gene expression and epigenetic imbalance is restored in our Nes-Cre+/-Kmt2a+/LSL mNPCs. We also demonstrated that the Nes-Cre+/-Kmt2a+/LSL mice showed phenotypic rescue of the WDSTS-like neurological dysfunction of the Kmt2a+/LSL mice.
Taken together, the results of this thesis expand on the current knowledge of WDSTS. We provide new evidence for the role of the CXXC domain of KMT2A in WDSTS pathogenesis, as well as shedding light on new roles of KMT2A in biological processes such as neural crest development. We successfully created and characterized a novel mouse model for researching WDSTS as well as providing compelling evidence of in utero malleability of the neurological dysfunction, making WDSTS a promising candidate for future therapeutic opportunities.
Locked until 2026-09-16