Sumarexem er húðofnæmi af gerð I í hestum sem orsakast af framleiðslu á IgE mótefnum gegn ofnæmisvökum upprunnum úr biti smámýs (Culicoides spp.). Sjúkdómsvaldurinn lifir ekki á Íslandi. Tíðni sjúkdómsins er mun hærri í útfluttum hestum samanborið við íslenska hesta sem eru fæddir á flugusvæðum. Sumarexem hefur mikil áhrif á velferð hrossa. Aðalofnæmisvakarnir sem valda exeminu hafa verið skilgreindir og rannsóknir á ónæmissvari sjúkdómsins hafa leitt í ljós að meingerð sjúkdómsins einkennist af ójafnvægi milli Th2 hjálparfrumna og T stýrifrumna. Sökum þessa opnast sá möguleiki að þróa ofnæmisvakasértæka ónæmismeðferð við sumarexemi. Við þróun á fyrirbyggjandi ónæmismeðferð höfum við áður sýnt fram á að bólusetning í kjálkabarðseitla með hreinsuðum ofnæmisvökum í ónæmisglæði framkallar týpu 1 (Th1)/T-stýrifrumu miðað ónæmissvar. Markmið verkefnisins var frekari þróun á fyrirbyggjandi ónæmismeðferð gegn sumarexemi. Einnig framleiðsla á endurröðuðum ofnæmisvökum í skordýrafrumum og byggi auk hreinsunar þeirra til notkunar í ónæmisprófum.
Nýskilgreindir aðalofnæmisvakar sem valda sumarexemi (Cul o 8, Cul o 9, Cul o 10 og Cul o 11) voru tjáðir í skordýrafrumum með Baculoveirukerfi (Bac). Endurröðuðu ofnæmisvakarnir voru hreinsaðir og notaðir í ónæmisprófum til að meta ónæmissvörun í kjölfar bólusetningar. Einnig var sýnt fram á notagildi þeirra í greiningaprófi fyrir sumarexem. Fjórir ofnæmisvakar (Cul o 2, Cul o 2P, Cul o 3 og Cul n 8) voru tjáðir í byggi í samstarfi við ORF Líftækni. Tveir þeirra (Cul o 2P og Cul o 3) voru hreinsaðir úr byggi.
Í ritgerðinni er gerð samanburðarrannsókn á sprautun í eitla og sprautun undir húð. Tólf heilbrigðum hestum á Íslandi var skipt í tvo hópa sem sprautaðir voru í kjálkabarðseitla eða undir húð, þrisvar sinnum með fjögurra vikna millibili með hreinsuðum Culicoides ofnæmisvökum (rCul o 2P, rCul o 3 og rCul n 4) í ónæmisglæði (aluminum hydroxide (alum) og monophosphoryl lipid A (MPLA)). Sex hross til viðbótar voru bólusett undir húð með hreinsuðum ofnæmisvökum og veiru-líkum ögnum (VLP) til samanburðar við MPLA á stýringu ónæmissvars á Th1 braut. Allar þrjár bólusetningaraðferðirnar örvuðu myndun á ofnæmisvaka sértækum IgG1, IgG4/7 og IgG5 mótefnum án framleiðslu á IgE. Mótefnin hindruðu að hluta bindingu IgE úr sumarexemshestum við ofnæmisvakana.
Engin marktækur munur var á mótefnasvörun í kjölfar sprautunar í eitla samanborið við sprautun undir húð. Boðefnasvörun í kjölfar örvunar á hvítfrumum sýndi fram á marktæka aukningu á IFN- og IL-4 framleiðslu hjá eitla og undir húð bólusetningahópum og IL-10 í hestum bólusettum í eitla. Engin marktækur munur var á boðefnasvörun milli hópanna, en framleiðsla á IFN- var aðeins hærri í hestum bólusettnum í eitla samanborið við hesta bólusetta undir húð og IL-4 framleiðsla var minni. Hægt er að álykta að sprautun undir húð geti verið nothæf við ónæmismeðferð gegn sumarexemi í hestum.
Bólusetning með alum/VLP örvaði lægri IgG4/7 og IgG5 mótefnasvörun samanborið við alum/MPLA, en IgG1 svörun var sambærileg. IgG4/7 svörun var marktækt lægri gegn Bac-rCul o 2P og Bac-rCul n 4 í hestum bólusettum með alum/VLP, einnig IgG5 svörun gegn Bac-rCul o 2P. Enn fremur var hindrunargeta á IgE bindingu við ofnæmisvakana minni í hestum bólusettum með alum/VLP. Heilt yfir var mótefnasvar minna með VLP sem ónæmisglæði samanborið við MPLA og hlutfall IgG5:IgG4/7 lægra. IgG5 hefur verið tengt við ofnæmi. Í ljósi þess að IgG5 svörun var lægri með VLP gæti það verið mögulegur kostur við ofnæmisvakasértæka ónæmismeðferð gegn sumarexemi í hestum, en frekari rannsókna er þörf.
Sermi úr fyrri rannsókn var notað til að bera saman mótefnasvörun í kjölfar bólusetningar með 10 µg og 20 µg af ofnæmisvaka. Marktæk aukning á ofnæmisvakasértækum IgG mótefnum varð bæði með 10 µg og 20 µg af ofnæmisvökum. Framleiðsla á IgG1 mótefnum var marktækt minni, IgG4/7 nokkuð minni og IgG5 sambærileg með 10 µg af ofnæmisvökum samanborið við 20 µg. Draga má þá ályktun að 20 µg af hverjum ofnæmisvaka í bólusetningu sé ákjósanlegur kostur við frekari þróun á ónæmismeðferð gegn sumarexemi í hestum.
Til að meta hvort bólusetning með hreinsuðum ofnæmisvökum í ónæmisglæði veiti vörn gegn sumarexemi var framkvæmd áskorunartilraun. Tuttugu og sjö heilbrigðir íslenskir hestar voru bólusettir í kjálkabarðseitla með níu hreinsuðum ofnæmisvökum (Cul o 1P, Cul o 2P, Cul o 3, Cul o 5, Cul o 7, Cul o 8, Cul o 9, Cul o 11 and Cul n 4) í alum/MPLA ónæmisglæðum. Bólusetningin var framkvæmd á Íslandi og í kjölfarið voru hrossin flutt út til Sviss. Hestarnir voru óvarðir gegn biti smámýs og þeim fylgt eftir í þrjú ár með reglulegri klínískri skoðun, blóðtöku og örvunarbólusetningu í upphafi annars og þriðja sumars. Á fyrsta ári höfðu 6 hestar (23,1%) fengið sumarexem, 13 hestar (50,0%) á öðru ári og 16 (61,5%) á því þriðja. Mótefnasvörun á fyrstu tveimur árunum var mæld gegn þremur ofnæmisvökum (Cul o 2P, Cul o 8 og Cul o 9). Sambærilegt mótefnasnið (miðgildi) var á IgG1, IgG4/7 og IgG5 gegn öllum þremur ofnæmisvökunum eftir bólusetningu og örvunarbólusetningu en mikill breytileiki var milli einstaklinga. Engin marktækur munur var á IgG mótefnasvari á neinum tímapunkti fyrstu tvö árin milli bólusettra hesta sem fengu sumarexem og þeirra sem voru heilbrigðir út tímabilið. Við lok annars árs var IgE mótefna framleiðsla gegn Bac-rCul o 8 og Bac-rCul o 9 ofnæmisvökum marktækt hærri í bólusettum hestum sem fengu sumarexem samanborið við þau sem voru heilbrigð út tímabilið. Bólusetningin veitti því ekki vörn gegn sumarexemi en frekari prófun á þeim sýnum sem safnað var gæti gefið innsýn í orsök þess að bóluefnið varði ekki hestana.
Insect bite hypersensitivity (IBH) is an allergic dermatitis of horses caused by IgE-mediated reactions to allergens of biting midges (Culicoides spp). Iceland is free of the causative agents but the prevalence of IBH in exported Icelandic horses is much higher than in Icelandic horses born in Culicoides rich environment. IBH can severely impact the well-being of affected horses. Numerous Culicoides allergens have been identified and studies on the pathogenesis demonstrate an imbalance between T-helper 2 (Th2) and regulatory T (Treg) cell subsets. This knowledge opens the possibility to develop an allergen-specific immunotherapy (AIT) against IBH. First studies showed that intralymphatic (i.l) injection of purified E. coli produced recombinant (r-) allergens with adjuvants induce a T-helper 1(Th1)/Treg focused immune response and is thus a promising approach for preventive AIT. The aim of the project is further development of preventive immunotherapy and production of r-Culicoides allergens in insect cells and transgenic barley for application in immunoassays.
Newly identified major Culicoides allergens (Cul o 8, Cul o 9, Cul o 10 and Cul o 11) were expressed and produced in insect cells (Bac). The r-allergens were purified and used in immune assays to evaluate responses following vaccination. The purified r-allergens were also found promising for use in diagnostic tests, distinguishing between IBH-affected and healthy horses. Four Culicoides allergens (Cul o 2, Cul o 2P, Cul o 3 and Cul n 8) were expressed in transgenic barley in collaboration with ORF Genetics and two of them (Cul o 2P and Cul o 3) purified.
For the development of preventive immunization, i.l. injection of purified E. coli produced r-allergens mixed with adjuvants was compared to the more practical subcutaneous (s.c.) route. Twelve healthy horses living in Iceland were injected, i.l. or s.c., three times with four-week interval, using the purified r-Culicoides allergens (rCul o 2P, rCul o 3 and rCul n 4) in a mixture with aluminium hydroxide (alum) and monophosphoryl lipid A (MPLA) as adjuvants. Six additional healthy horses were vaccinated s.c. with the same r-Culicoides allergens in alum and virus-like particles (VLP) for comparison with MPLA adjuvant for induction of Th1 type immune responses. The three vaccination methods significantly induced allergen-specific IgG1, IgG4/7 and IgG5 subclass antibody responses without allergen-specific IgE production. Furthermore, the antibodies generated were able to block the binding of IgE from IBH-affected horses to the corresponding r-allergens. Interestingly, there was no significant difference in the antibody response between the i.l. and s.c. injection routes at any time point following immunisation. Upon re-stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), there was a significant increase in IFN- and IL-4 production in both vaccination groups compared to pre-vaccination, while a significant increase in IL-10 was only observed in the i.l. group. Horses vaccinated i.l. produced slightly more IFN- and less IL-4 as compared to the horses injected s.c., but the difference did not reach significance. It can be concluded that the simpler s.c. injection could be an option in immunotherapy against IBH. Use of VLP instead of MPLA as immunomodulator induced weaker IgG4/7 and IgG5 while IgG1 was similar in both groups. The IgG4/7 response was significantly lower against Bac-rCul o 2P and Bac-rCul n 4 in the s.c./VLP vaccination group compared to s.c./MPLA, as well for IgG5 responses against Bac-rCul o 2P. Furthermore, the IgE blocking capacity of the allergen-specific IgG antibodies induced following vaccination with alum/VLP was weaker compared to alum/MPLA. In conclusion, addition of VLPs as immunomodulator instead of MPLA resulted in a weaker antibody response and lower IgG5:IgG4/7 ratio. IgG5 has been associated with allergy. In the light of the low IgG5 response, VLP might present a promising adjuvant system for AIT against IBH but further investigation is needed. Sera from a previous vaccination experiment was used for comparison of the antibody response following i.l. immunization with 10 or 20 µg r-allergen in alum/MPLA. Both induced a significant IgG antibody response following vaccination. The 10 µg induced significantly lower IgG1 antibody levels as compared to 20 µg, the IgG4/7 response was slightly lower and the IgG5 was similar. Based on these results, 20 µg of each r-allergen in vaccination seems preferable for AIT against IBH.
To test the efficacy of a preventive allergen immunotherapy, a challenge experiment was conducted. Twenty - seven healthy Icelandic horses were vaccinated i.l. with 20 µL each of nine E. coli produced r-Culicoides allergens (Cul o 1P, Cul o 2P, Cul o 3, Cul o 5, Cul o 7, Cul o 8, Cul o 9, Cul o 11 and Cul n 4) in alum/MPLA. The vaccination was done in Iceland and the horses subsequently exported to Switzerland. They were kept unprotected from insect bites to ensure exposure to Culicoides and followed for three years with regular clinical examination and blood sampling. One horse was withdrawn from the study and excluded from sample analysis. Six horses developed IBH (23.1%) in the first year. In the second year a total of 13 horses (50.0%) and in the third year 16 (61.5%) horses were affected with IBH. The antibody response during the first two years was analysed against three Culicoides allergens (Cul o 2P, Cul o 8 and Cul o 9). A comparable time course pattern between horses that remained healthy and those that developed IBH was observed for IgG1, IgG4/7 and IgG5 antibody levels against all three r-allergens following vaccination and booster vaccination. However, there was considerable individual variability among horses. The IgG subclass response showed no difference at any time-point between horses which developed IBH and horses that remained healthy. However, at the end of the second Culicoides season IBH-affected horses had significantly higher IgE levels against Bac-rCul o 8 and Bac-rCul o 9. In conclusion, the vaccine did not reduce the incident of IBH in exported horses based on reported prevalence. Further analysis of collected samples could provide insights on why the vaccine does not protect the horses against IBH.
