Heterotypic interactions between endothelial and cancer cells in breast cancer progression

Abstract

The microenvironment is increasingly being recognized as a key player in supporting cancer progression. Therefore, investigating heterotypic interactions between cancer cells and their microenvironment is important for improving our understanding of how specific cell types support tumor growth and facilitates metastasis. The intralobular breast stroma is highly vascularized and endothelial cells (ECs) are a major cell type in breast cancer microenvironment. Here, we analyze crosstalk between non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells and endothelial cells (ECs) using the cellular model of D492, D492M (both non-tumorigenic) and D492HER2 (tumorigenic). D492 is a breast epithelial cell-line that in co-culture with ECs underwent epithelial-tomesenchymal- transition and gave rise to D492M. D492HER2 was generated by overexpressing the HER2-oncogene in D492. Treatment with conditioned medium (CM) from D492HER2 increased endothelial network formation and induced an endothelial feedback increasing cancer cell migration and invasion. Secretome analysis identified extracellular matrix protein 1 (ECM1) and chitinase-3-like protein 1 (CHI3L1/YKL-40) as pro-angiogenic candidates in CM from D492HER2. ECM1 knockdown in D492HER2 reduced the pro-angiogenic properties of D492HER2 and prevented endothelial feedback induction. ECs treated with D492HER2-CM and recombinant ECM1 (rECM1) showed upregulated expression of NOTCH1 and NOTCH3. Inhibition of endothelial NOTCH signaling blocked the increase in endothelial network formation upon rECM1 treatment as well as the induction of the feedback promoting cancer cell migration and invasion. Knockdown of ECM1 in D492HER2 further led to decreased basal marker expression and upregulation of GATA-binding protein 3 (GATA3), which is associated with better prognosis. Knockdown of YKL-40 also reduced pro-angiogenic properties of D492HER2, as well as migration, invasion and formation of grape-like structures in 3D. These data show that cancer cells affect their vascular niche through secretion of ECM1, resulting in induction of an endothelial feedback enhancing cancer cell tumorigenicity. Further, these data suggest ECM1 as a novel mediator of GATA3 and of endothelial NOTCH signaling. YKL-40 may contribute to cancer aggressiveness by increasing migration, invasion and pro-angiogenic properties. Targeting the crosstalk between cancer cells and their vascular niche may provide opportunities for improved treatment and development of novel cancer treatments.

Það verður sífellt ljósara að umhverfi krabbameinsfruma, þ.m.t. frumuríkur stoðvefur, spilar lykilhlutverk í stuðningi við framþróun æxlisvaxtar. Það er mikilvægt að rannsaka samskipti milli krabbameinsfruma og stoðvefjar til að skilja betur hvernig ákveðnar frumutegundir í stoðvef styðja við vöxt æxlis og auðvelda meinvarpamyndun. Kirtilgangar og kirtilber brjósta eru umlukin æðaþelsríkum stoðvef og hafa rannsóknir sýnt fram á að æðaþelsfrumur stuðla að vexti og sérhæfingu þekjufruma í brjóstkirtli. Jafnframt er velþekkt að nýmyndun æða er nauðsynlegt skref fyrir framþróun æxlisvaxtar. Markmið þessa verkefnis var að rannsaka víxlverkandi samskipti milli eðlilegra- og illkynja þekju- og æðaþelsfruma með því að notast við frumulínurnar D492, D492M (sem hvorug myndar æxli í músum) og D492HER2 (sem er æxlismyndandi). D492 er eðlileg brjóstaþekjufrumulína með stofnfrumueiginleika sem í samrækt með æðaþeli undirgekkst bandvefsumbreytingu þekjufruma (e. epithelial-to-mesenchymal transition) og myndaði þannig D492M. D492HER2 var mynduð með yfirtjáningu á HER2 krabbameinsgeninu í D492 og hefur eiginleika illkynja æxlisfruma og sýnir að hluta til svipgerð bandvefsfruma. Æðaþelsfrumur sem ræktaðar voru í sermislausu æti frá D492HER2 frumum sýndu aukna myndun æðanets í samburði við D492 og D492M. Frumuæti frá æðaþelsfrumum sem áður höfðu verið ræktaðar í frumuæti frá D492HER2 auka frumuskrið D492HER2 fruma, sem gefur til kynna hugsanlega afturvirkni (e. feedback). Með samanburðarkortlagningu á próteinmengi (e. secretome) ætis sem D492 og D492HER2 frumur höfðu verið ræktaðar í greindum við próteinin ECM1 og YKL-40 í D492HER2 frumuætinu sem kandidata fyrir æðasprotamyndun í frumurækt. Með því að slá út ECM1 í D492HER2 dró úr eiginleikum D492HER2 til að stuðla að æðasprotamyndun og afturvirknisáhrif á frumuskrið og ífarandi hegðun D492HER2 voru hindruð. Æðaþelsfrumur sem ræktaðar voru í sermislausu æti frá D492HER2 frumum með „recombinant“ ECM1 (rECM1) sýndu aukna tjáningu á NOTCH1 og NOTCH3. Bæling á NOTCH boðleiðinni í æðaþelsfrumum hindraði aukningu á æðasprotamyndun í frumurækt af völdum rECM1 og hindraði einnig afturvirknisáhrif á frumuskrið og ífarandi hegðun krabbameinsfruma. Niðursláttur (e. knockdown) á ECM1 í D492HER2 leiddi ennfremur til minnkaðrar tjáningar á basalfrumu svipgerð og aukningar á tjáningu GATA3 umritunarþáttarins sem er lykilþáttur í sérhæfingu kirtilþekjufruma og sem er einnig tengdur betri lífslíkum. Niðursláttur á YKL-40 dró einnig úr getu D492HER2 til að stuðla að æðasprotamyndun í frumurækt, dró úr frumuskriði og ífarandi hegðun og myndun berjaklasa formgerðar í þrívíðri rækt. Niðurstöðurnar sýna að krabbameinsfrumur, í þessu tilfelli HER2 yfirtjáandi brjóstaþekjufrumur, hafa áhrif á æðarnar umhverfis þær með því að seyta ECM1 sem hvatar æðavöxt og ýtir undir afturverkandi áhrif frá æðaþelsfrumunum á krabbameinsfrumurnar þannig að æxlismyndandi eiginleikar þeirra aukast. Ennfremur sýna niðurstöðurnar að ECM1 getur miðlað boðum í gegnum GATA3 og NOTCH boðleiðina í æðaþeli. YKL-40 ýtir hugsanlega undir illkynja hegðun krabbameina með því að auka frumuskrið, ífarandi hegðun og eiginleikann til að stuðla að æðasprotamyndun. Niðurstöður þessarar rannsóknar benda til þess að meðferðarúrræði sem beinast gegn víxlverkandi samskiptum krabbameinsfruma og æðaþelsfruma gætu reynst góð í baráttunni gegn krabbameini.