The role of MITF in regulating transcriptional cell states in melanoma

Abstract

The pigment producing melanocytes are derived from the neural crest cells and form precursor cells called melanoblasts. These cells proliferate and migrate to their destination in skin, hair and other organs where they differentiate into melanocytes which produce the pigment melanin. The Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) is indispensable for the establishment of fully differentiated melanocytes. MITF controls the expression of genes required for melanocyte survival, proliferation and differentiation. Melanoma cells thus exploit the transcriptional activity of MITF to foster cancer progression. However, the role of MITF in regulating the metastatic potential of melanoma cells is complex and often leads to inconsistent findings. The scope of this thesis was to further elucidate the functional role of MITF in melanoma development. Our findings revealed that MITF knock out (KO) melanoma cells exhibit a reduced proliferation rate compared to the control cell line. Consistent with that, the expression of cell cycle regulators that are known targets of MITF was affected in the KO cells. Surprisingly, both the migration and invasion potential of MITF-KO cells were significantly reduced compared to empty vector cell lines. In contrast, transient depletion of MITF did not affect the invasion potential of melanoma cells. RNA-sequencing followed by differential gene expression analysis revealed a gain of extracellular matrix and neuronal related genes in MITF-KO cells, whereas pigmentation genes that are specific to melanocyte differentiation were lost. Accordingly, the gene expression profile of MITF-KO cells was negatively correlated with the gene signature of melanocytes, whereas a positive correlation was observed with neural crest and Schwann cell signature. Interestingly, the major components of focal adhesions, including paxillin (PAX) and focal adhesion kinase (FAK) are direct targets of MITF and their expression was induced upon MITF depletion. Well in line, the number of FAK and PAX positive focal points were increased in MITF-KO and transient knockdown cell lines. Additionally, expression of N-cadherin was increased in both models whereas E-cadherin was decreased, reflecting marks of mesenchymal transition. Published ChIPseq data show that both E- and N-cadherins have MITF binding sites in their introns and promoter regions, suggesting that they are direct MITF targets. The level of histone modifications reflected major changes in gene expression observed in the MITF-KO cells. The H3K4me3 active mark and the H3K9me3 repressive mark were both altered in the promoter of genes that showed differential expression in MITF-KO cells. Consistent with this, the expression of the histone modifiers PRDM7 and SETDB2 was reduced in the MITF-KO cells. Taken together, we conclude that the loss of MITF drives cells into a de-differentiated state that is governed by a neural crest-like transcriptional program. Furthermore, the maintenance of neural crest gene repertoire is facilitated by epigenetic modifiers that are under MITF regulation. The second part of this thesis investigated the genome wide overlapping targets of the transcription factors MITF, IRF4 and TFEB. All three factors have been shown to collaborate in regulating gene expression in melanoma and melanocytes. Chromatin immunoprecipitation sequencing was performed using eGFP tagged TFEB and IRF4 proteins and genome wide binding sites were identified for each factor. Analysis of the overlapping target genes revealed that MITF and TFEB share binding to lysosomal genes whereas MITF and IRF4 share binding to pigmentation and immue-related genes. Statistically differentially bound sites were identified for each factor, in which MITF displayed unique binding to genes related to neuronal development. TFEB showed exclusive binding to genes related to DNA metabolic processes, whereas IRF4 revealed exlusive binding to genes involved in the hematopoietic system. Thus, the distinct and overlapping binding regions of each factor were identified, which enabled us to dissect the co-operative and independent transcriptional activity of each factor.

Litfrumur (e. melanocytes) eiga uppruna sinn í taugakambi (e. neural crest) sem forverafrumur sem fjölga sér síðan og ferðast til áfangastaða sinna í húð, hári og öðrum líffærum þar sem þær sérhæfast og mynda litarefnið melanín. Litfrumur geta ummyndast í æxlisfrumur og myndað sortuæxli en eitt einkenna þeirra er fareiginleikar. Umritunarþátturinn MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) er nauðsynlegur fyrir myndun og sérhæfingu litfruma og stjórnar tjáningu gena sem eru nauðsynleg fyrir lifun, fjölgun og sérhæfingu frumanna. Sortuæxlisfrumur nýta MITF til æxlismyndunar. Hlutverk MITF í stjórnun frumufars og íferðar hefur hins vegar ekki verið að fullu ljóst. Í verkefni þessu var skoðað hvað gerist þegar MITF genið er slegið út í sortuæxlisfrumum með hjálp CRISPR tækninnar. Í ljós kom að frumur þessar skipta sér hægar en viðmiðunarfrumur og áhrif sáust á tjáningu gena sem eru mikilvæg fyrir frumuhringinn og eru þekkt markgen MITF. Þetta staðfestir fyrri niðurstöður um að MITF er mikilvægt fyrir stjórnun frumuskiptinga í sortuæxlisfrumum. Hins vegar höfðu sortuæxlisfrumurnar sem skortir MITF mun minni fareiginleika en viðmiðunarfrumurnar. Þegar MITF var tímabundið slegið niður með miRNA aðferð sáust hins vegar engin áhrif á frumufar. Með því að raðgreina RNA fruma sem skortir MITF og bera saman við viðmiðunarfrumur kom í ljós að tap á MITF leiddi til taps á genum sem hafa með myndun litarins að gera en aukningar í tjáningu gena sem tengjast utanfrumuefni (e. extracellular matrix), og taugamyndun. KO frumurnar líkjast helst taugakambs- og Schwann- frumum. Einnig kom í ljós að gen sem tjá fyrir mikilvægum proteinum sem mynda “focal adhesions” í frumum, svo sem paxillin (PAX) og Focal Adhesion Kinase (FAK) eru markgen MITF og tjáning þeirra var örvuð þegar MITF vantaði. Í frumum án MITF (bæði CRISPR og miRNA frumum) jókst fjöldi FAK og PAX-jákvæðra punkta. Tjáning Ncadherin jókst en E-cadherin minnkaði við tap á MITF en þetta eru merki um að frumurnar hafi breytt sér úr þekjuvefsfrumum í bandvefsfrumur en það ferli kallast bandvefsumbreyting þekjufruma (e. epithelial-mesenchymal transition eða EMT) og er mikilvægt í ummyndun fruma í krabbameinsfrumur. Greining á ChIP-seq gögnum sýna að bæði N- og E-cadherin genin eru með MITF bindiset í innröðum og stýrisvæði en það bendir til að MITF stjórni beint tjáningu þeirra. Í frumum sem skortir MITF verða miklar breytingar í tjáningu gena, mun meiri en unnt er að skýra einungis með beinum áhrifum MITF. Til að athuga hvort hluta breytinganna mætti skýra með utangenaerfðum var skoðað hvort breytingar hefðu orðið á histónaumbreytingunum H3K4me3 og H3K9me3 en umbreytingar þessar eru merki um virkt litni annars vegar og óvirkt litni hins vegar. Umbreytingar þessar fundust í stýriröðum gena sem voru mismunandi tjáð í frumum sem skortir MITF og viðmiðunarfrumum sem tjá MITF. Áhugavert er að gen sem tákna fyrir umbreytingarensímunum PRDM7 og SETDB2 voru mun minna tjáð í frumum sem skortir MITF en í viðmiðunarfrumum. Vinna þessi sýnir að tap á MITF leiðir til þess að frumurnar fá einkenni taugakambsfruma og að viðhald slíkar fruma er háð umbreytingarensímum sem setja utangenamerki á histón og að þau ensím eru háð MITF. MITF getur unnið með öðrum umritunarþáttum svo sem IRF4 og TFEB í litfrumum og sortuæxlisfrumum en ekki er ljóst hversu margþætt þetta samstarf er í raun. Í seinni hluta ritgerðarinnar var skörun í bindingu umritunarþáttanna þriggja MITF, IRF4 og TFEB skoðuð í sortuæxlisfrumum með notkun ChIP-seq aðferðarinnar. Notast var við eGFP-merkt TFEB og IRF4 prótein of ChIP-seq aðferðin notuð til að greina bindiset próteinanna í erfðamengi 501mel sortuæxlisfruma. Greining á skörun bindiseta sýndi að MITF og TFEB bindast við gen sem taka þátt í myndun lýsósóma en MITF og IRF4 skarast þegar kemur að genum sem mynda lit og taka þátt í ónæmiskerfinu. MITF var frábrugðið hinum þáttunum í að bindast við gen sem taka þátt í myndun taugakerfisins, TFEB var einstakt í að bindast við gen sem taka þátt í efnaskiptum DNA en IRF4 binst við gen sem tengjast myndun og starfsemi blóðfruma. Við höfum því greint skörun þessara umritunarþátta en einnig einstakt hlutverk þeirra. Þetta leyfir okkur að greina hvernig þessir þættir vinna saman í litfrumum og hvaða hlutverki þeir gegna í þeim.