Atlantic cod (Gadus morhua) trypsin – isoenzyme diversity and antiviral activity

Abstract

The aim of the thesis work was to identify and characterise different trypsin isoenzymes from a benzamidine-purified Atlantic cod (Gadus morhua) trypsin isolate. Another aim was to test the ability of cod trypsin to deactivate upper respiratory tract viruses. Initially, the stability of the trypsin isoenzymes I, X and ZT, in terms of temperature and pH, was characterised along with their sensitivity to various inhibitors. Multiplex substrate profiling by mass spectrometry of trypsin ZT and trypsin I revealed a difference in substrate specificity between the two trypsin isoenzymes. Furthermore, trypsin X, I and ZT showed a difference in sensitivity to inhibitors. The deactivation potential of the cod trypsin isolate was tested on several upper respiratory tract viruses. The results demonstrated that cod trypsin can deactivate rhinovirus A and coxsackievirus B. Furthermore, cod trypsin deactivated coronavirus. This was shown by using a Renilla luciferase assay and confirmed with a viability test. Furthermore, Western blot analysis showed that cod trypsin degraded recombinant coronavirus spike protein. The SARS coronavirus spike protein was treated with cod trypsin isoenzymes I and ZT to test the contribution of each isoenzyme to the cleavage. Both isoenzymes cleaved the SARS coronavirus spike protein at low trypsin concentrations. In conclusion, the results show that cod trypsin X and cod trypsin ZT have interesting characteristics differing from the previously characterised cod trypsin I. Cod trypsin was also shown to deactivate different viruses and to cleave recombinant coronavirus spike proteins.

Markmið doktorsverkefnisins var að einangra og skilgreina mismunandi trypsín ísóensím úr bensamidín hreinsaðri trypsínblöndu. Jafnframt að rannsaka hvort þorskatrypsín geti óvirkjað veirur sem valda sýkingum í efri öndunarvegi. Í grein I og II var byrjað á að greina trypsín isóensímin X og ZT úr benzamidine hreinsaðri trypsín blöndu. Stöðugleiki þeirra gagnvart breytingum á hitastigi, sýrustigi og ensímhindrum var rannsakaður og borinn saman við áður þekkt trypsín I. Notuð var nýstárleg aðferð, sértæk hvarfefnamæling með massagreiningu, til að bera saman sérhæfni trypsín ísóensíma I og ZT en niðurstöðurnar leiddu í ljós umtalsverðan mun. Þá var einnig nokkur breytileiki í bindingu við ensímhindra á milli trypsín ísóensíma I, X og ZT. Eiginleiki trypsínblöndunnar til að óvirkja veirur, sem sýkja frumur í efri öndunarvegi var rannsakaður. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að trypsínblandan óvirkjar rhinoveiru A og coxsackieveiru B. Meðhöndlun með lágum styrk af þorskatrypsíni leiddi einnig til óvirkjunar coronaveiru. Sýnt var fram á þennan eiginleika þorskatrypsíns með notkun Renilla luciferase mælingu ásamt mælingum á lífvænleika veirumeðhöndlaðra fruma. Þá var sýnt fram á getu þorskatrypsínblöndunnar við að kljúfa coronaveiru spike prótein með Western blot aðferð. Hæfni trypsín ísóensíma I og ZT við að brjóta niður SARS spike prótein var sambærileg byggt á SDS-PAGE greiningu. Niðurstöðurnar sýna að þorskatrypsín ísóensím X og ZT hafa áhugaverða eiginleika sem eru frábrugðnir eiginleikum trypsíns I, sem áður hefur verið skilgreint. Einnig var sýnt fram á að þorskatrypsín getur óvirkjað mismunandi öndunarfæraveirur og brotið niður spike prótein sem finnast á yfirborði coronaveira, þar með talið SARS veira.