The aim of the thesis work was to identify and characterise different trypsin
isoenzymes from a benzamidine-purified Atlantic cod (Gadus morhua) trypsin
isolate. Another aim was to test the ability of cod trypsin to deactivate upper
respiratory tract viruses.
Initially, the stability of the trypsin isoenzymes I, X and ZT, in terms of
temperature and pH, was characterised along with their sensitivity to various
inhibitors. Multiplex substrate profiling by mass spectrometry of trypsin ZT and
trypsin I revealed a difference in substrate specificity between the two trypsin
isoenzymes. Furthermore, trypsin X, I and ZT showed a difference in sensitivity to
inhibitors.
The deactivation potential of the cod trypsin isolate was tested on several upper
respiratory tract viruses. The results demonstrated that cod trypsin can deactivate
rhinovirus A and coxsackievirus B. Furthermore, cod trypsin deactivated
coronavirus. This was shown by using a Renilla luciferase assay and confirmed with
a viability test. Furthermore, Western blot analysis showed that cod trypsin degraded
recombinant coronavirus spike protein. The SARS coronavirus spike protein was
treated with cod trypsin isoenzymes I and ZT to test the contribution of each
isoenzyme to the cleavage. Both isoenzymes cleaved the SARS coronavirus spike
protein at low trypsin concentrations.
In conclusion, the results show that cod trypsin X and cod trypsin ZT have
interesting characteristics differing from the previously characterised cod trypsin I.
Cod trypsin was also shown to deactivate different viruses and to cleave
recombinant coronavirus spike proteins.
Markmið doktorsverkefnisins var að einangra og skilgreina mismunandi trypsín
ísóensím úr bensamidín hreinsaðri trypsínblöndu. Jafnframt að rannsaka hvort
þorskatrypsín geti óvirkjað veirur sem valda sýkingum í efri öndunarvegi.
Í grein I og II var byrjað á að greina trypsín isóensímin X og ZT úr benzamidine
hreinsaðri trypsín blöndu. Stöðugleiki þeirra gagnvart breytingum á hitastigi, sýrustigi
og ensímhindrum var rannsakaður og borinn saman við áður þekkt trypsín I. Notuð
var nýstárleg aðferð, sértæk hvarfefnamæling með massagreiningu, til að bera
saman sérhæfni trypsín ísóensíma I og ZT en niðurstöðurnar leiddu í ljós
umtalsverðan mun. Þá var einnig nokkur breytileiki í bindingu við ensímhindra á milli
trypsín ísóensíma I, X og ZT.
Eiginleiki trypsínblöndunnar til að óvirkja veirur, sem sýkja frumur í efri
öndunarvegi var rannsakaður. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að trypsínblandan óvirkjar
rhinoveiru A og coxsackieveiru B. Meðhöndlun með lágum styrk af þorskatrypsíni
leiddi einnig til óvirkjunar coronaveiru. Sýnt var fram á þennan eiginleika
þorskatrypsíns með notkun Renilla luciferase mælingu ásamt mælingum á
lífvænleika veirumeðhöndlaðra fruma. Þá var sýnt fram á getu
þorskatrypsínblöndunnar við að kljúfa coronaveiru spike prótein með Western blot
aðferð. Hæfni trypsín ísóensíma I og ZT við að brjóta niður SARS spike prótein var
sambærileg byggt á SDS-PAGE greiningu.
Niðurstöðurnar sýna að þorskatrypsín ísóensím X og ZT hafa áhugaverða
eiginleika sem eru frábrugðnir eiginleikum trypsíns I, sem áður hefur verið skilgreint.
Einnig var sýnt fram á að þorskatrypsín getur óvirkjað mismunandi
öndunarfæraveirur og brotið niður spike prótein sem finnast á yfirborði coronaveira,
þar með talið SARS veira.