Lífefni í mænuvökva nýbura: forspárgildi fyrir heilaskaða. Tengsl við lifun og röskun á taugaþroska

Abstract

Bakgrunnur Ágrip Börn sem verða fyrir súrefnisskorti í fæðingu og börn sem fæðast fyrir fulla meðgöngu eiga á hættu að lifa ekki af eða hljóta varanlegan heilaskaða. Hættan á þessum fylgikvillum hefur ekki minnkað á síðustu áratugum þrátt fyrir miklar læknisfræðilegar framfarir. Súrefnisskortur í fæðingu og önnur áföll setja í gang efnaferla í heilanum sem leiða til truflunar á starfsemi taugafruma og jafnvel taugafrumudauða. Sýkingar eru algengur fylgikvilli þess að fæðast fyrir tímann og eru ein helsta orsök hárrar dánartíðni fyrirbura á nýburaskeiði. Þær tengjast einnig truflunum í öndun og blóðrás vegna áhrifa bólguefna á stjórnstöð í heilastofni. Bólguferli gegna lykilhlutverki sem orsakavaldur heilaskaða bæði eftir sýkingar og við súrefnisþurrð. Mikilvægt er að hafa í huga að óþroskaður heili nýbura, einkum fyrirbura, er viðkvæmur fyrir alls kyns áreiti á nýburaskeiði. Truflun á þroska heilans, jafnvel án sjáanlegs meins í heilavef, getur valdið því að barnið hljóti varanlegar fatlanir. Mögulegt er að mæla í lífsýnum efni svo sem bólguefni og prótein sem tengjast hinum flóknu efnaferlum heilaskaðans og/eða heilaþroskans. Markmið og tilgátur Markmið þessa verkefnis var að finna leiðir til að greina heilaskaða og meta áhættu á taugaþroskaröskun hjá nýburum. Til að ná þeim markmiðum vildum við finna lífefni í mænuvökva sem mundu geta: i) gefið upplýsingar um útbreiðslu og alvarleika heilaskaða hjá fullburða börnum sem fengið höfðu súrefnisskort í fæðingu sem og horfur þessara barna, ii) spáð fyrir um framtíðarhorfur hjá fyrirburum, og iii) útskýrt truflanir á hjartslætti og öndun hjá nýburum með sýkingar. Megintilgátur okkar voru í fyrsta lagi, að magn bólguefna i) mundi mælast hækkað í mænuvökva hjá börnum sem lent höfðu í súrefnisskorti í fæðingu og tengdust bæði meiri alvarleika skaðans og verri horfum, ii) að þau væru hærri hjá fyrirburum í samanburði við fullburða börn sem ekki höfðu hlotið súrefnisskort í fæðingu, og að iii) hækkun á bólguefninu Prostaglandin E2 (PGE2) mundi tengjast, ekki einungis súrefnisskorti í fæðingu, heldur einnig truflunum í öndun og hjartslætti hjá sýktum nýburum. Í öðru lagi að önnur lífefni, sem sérstaklega tengjast hinum ýmsu efnaferlum heilaskaða hjá nýburum, væru hækkuð í mænuvökva hjá þeim iii börnum sem orðið höfðu fyrir súrefnisskorti í fæðingu og að þau tengdust alvarleika skaðans og horfum barnanna. Í þriðja lagi að próteinmynstur í mænuvökva væri mismunandi hjá fyrirburum annars vegar og fullburða börnum hins vegar og að magn próteina sem tengjast hinum ýmsu efnaferlum í heilaþroskanum hefðu forspárgildi um taugaþroskaraskanir hjá fyrirburum. Aðferðir Til að kanna tilgátur okkar mældum við lífefni í mænuvökva fullburða barna sem orðið höfðu fyrir súrefnisskorti í fæðingu, hjá fyrirburum með eða án sýkingar og hjá fullburða börnum í viðmiðunarhópi. Fullburða börn sem voru innlögð á nýburagjörgæsludeild Karolinska sjúkrahússins í Stockholm á tímabilinu 2000 til 2004 vegna fósturköfnunar voru höfð í rannsóknum I, III og IV. Öll börnin uppfylltu skilyrði fyrir heilakvilla af völdum súrefnisskorts í fæðingu og var mænuástunga gerð sem liður í almennri uppvinnslu. Viðmiðunarhópur var börn, einnig fædd eftir fulla meðgöngu, sem voru inniliggjandi á Karolinska sjúkrahúsinu vegna gruns um sýkingu en höfðu ekki lent í súrefnisskorti í fæðingu og voru ekki með heilakvilla. Fyrirburar innlagðir á Karolinska sjúkrahúsið á árunum 2002 til 2004 sem voru mænustungnir vegna gruns um sýkingu voru í rannsóknum II og V. Fullburða börn sem lágu á sama tíma á Karolinska sjúkrahúsinu og voru einnig mænustungin vegna gruns um sýkingu voru viðmiðunarhópur. Mænuvökvi frá þessum börnum var rannsakaður með ELISA aðferð. Magn PGE2 og PGE2 myndefnis (PGEM) var mælt í rannsókn I og II og magn interleukin 6 (IL-6) og fas-ligand (FasL) í rannsókn III. Prótein-svipgerð í mænuvökva í rannsóknum IV og V var mæld með tækni sem mælir mörg prótein samtímis og byggir á sækni próteina í fyrirfram gerða mótefnalausn. Mótefnalausnin var gerð úr próteinögnum sem valdar voru úr próteingagnabanka. Magn 178 próteina var mælt í sýnunum. Öllum börnum var fylgt eftir til 18-24 mánaða aldurs. Niðurstöður Helstu niðurstöður okkar voru, í fyrsta lagi, að magn bólguefna eykst í mænuvökva, bæði við blóðsýkingar og fósturköfnun, og hafa notagildi við greiningu á sjúkdómsástandi og forspárgildi um horfur sjúklinga. Í öðru lagi, að ýmis prótein sem tengjast efnaferlum í meingerð heilaskaða af völdum súrefnisskorts safnast upp í mænuvökva eftir fósturköfnun. Aukið magn þessara próteina tengist verri heilaskaða og magn þeirra í mænuvökva hafði tengsl við framtíðarhorfur barnanna. Í þriðja lagi sýndum við að prótein- svipgerð í mænuvökva er ekki eins hjá fyrirburum og hjá fullburða börnum. iv

Einnig sáum við að hjá fyrirburum sem greindust með taugaþroskaraskanir fyrir tveggja ára aldur var skortur á ýmsum próteinum sem taka þátt í þroska heilans. Í rannsóknum I og II mældust bólguefnið PGE2 og afleiða þess PGEM hækkuð í mænuvökva. Hjá börnum með sýkingar (rannsókn II) höfðu þessi lífefni notagildi sem greiningartæki snemma í sjúkdómsferlinu og tengdust truflun á hjartslætti og öndunarstarfsemi. Hjá börnum með heilakvilla eftir fósturköfnun (rannsókn I) voru tengsl á milli magns þessara lífefna og alvarleika heilaskaðans, bæði gráðu heilakvilla og horfur barnanna. IL-6 er annað bólguefni sem mældist í auknu magni í mænuvökva þeirra barna sem urðu fyrir súrefnisskort í fæðingu og tengdist það verri heilaskaða (rannsókn III). Í þeirri rannsókn voru einnig tengsl á milli magns FasL og alvarleika heilaskaða en það er lífefni sem tekur þátt í dauða taugafruma í flókinni meingerð heilaskaða eftir súrefnisskort. IL-6 og FasL notuð saman spáðu fyrir um alvarleika heilaskaðans, gráðu heilakvilla og horfur, með miklu næmi og sértæki. Próteinmynstur í mænuvökva barna með heilakvilla eftir fósturköfnun (rannsókn IV) einkenndist af bólguferlum og öðrum próteinum sem tengjast efnaferlum heilaskaða af völdum súrefnisskorts. Hækkað magn þessara próteina tengdist meiri einkennum um heilakvilla og verri langtímahorfum þessara barna. Próteinmynstur í mænuvökva fyrirbura var öðruvísi en hjá fullburða börnum (rannsókn V), og var þar sérstaklega áberandi hækkun á bólgupróteinum hjá fyrirburum. Í þeirri rannsókn var magn próteina sem tengdust heilaþroskanum minna í mænuvökva þeirra fyrirbura sem greindust með óeðlilegan taugaþroska við 18-24 mánaða leiðréttan aldur en hjá fyrirburum sem voru með eðlilegan taugaþroska. Ályktun Útfrá þessum niðurstöðum ályktum við að ýmis bólguefni og önnur lífefni í mænuvökva geta verið gagnleg við mat á ástandi og horfum nýbura sem eru í hættu á heilaskaða eða taugaþroskaröskun. Þau geta verið gagnleg i) við greiningu á heilakvilla af völdum súrefniskorts í fæðingu, ii) við greiningar á sýkingum ii) við mat á alvarleika heilaskaða hjá nýburum sem hlotið hafa fósturköfnun og við mat á þörfinni fyrir meðferð og iii) við mat á framtíðarhorfum fyrirbura, og fullburða barna með heilakvilla. Að auki gefa þessar niðurstöður mikilvægar upplýsingar um meingerð heilaskaðans, sem gætu nýst við þróun á nýjum meðferðarúrræðum.

Background Prematurity with its complications and hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) following birth asphyxia in full-term infants are the most important contributors to a high incidence of early neonatal mortality and lifelong neurodevelopmental disabilities originating in the neonatal period. Devastating long-term outcomes have not decreased markedly within the last decades despite extensive medical advances. Various injurious processes are stimulated by external insult and can lead to brain cell damage. This includes inflammatory processes, which are important contributors to brain injury in both sepsis and hypoxia-ischemia. Sepsis is a common complication of prematurity and the most frequent cause of mortality in the neonatal period. It is associated with cardiorespiratory disturbances, as a result of a disrupted autonomic control in the brain stem. It is important to bear in mind the vulnerability of the developing brain, especially of the preterm infant. Diverse postnatal events may alter normal brain development and lead to an adverse neurodevelopmental outcome, even without apparent lesion in the brain tissue. Measuring biomarkers in body fluids that correlate with the processes of brain injury and/or brain development is feasible. Aims The focus of this thesis was to diagnose perinatal brain injury and identify infants at risk of adverse neurodevelopmental outcomes. Specifically, the aim was to discover biomarkers in cerebrospinal fluid (CSF) that would: i) identify the degree of HIE and the clinical outcome following perinatal asphyxia, ii) predict the neurodevelopmental outcome of preterm infants, and iii) correlate with the onset of neonatal sepsis and cardiorespiratory disturbances. We first hypothesized that neuroinflammation would be observed following birth asphyxia and that inflammatory mediators could serve as biomarkers of the degree of HIE and the clinical outcome of the patients. Furthermore, the inflammatory mediator prostaglandin E2 (PGE2) would correlate with the consequences of perinatal asphyxia and early neonatal sepsis and autonomic dysfunction. Secondly, the levels of brain-specific proteins, including apoptotic markers, cell structural proteins, and synaptic proteins, in CSF, could serve as diagnostic and prognostic biomarkers in HIE. Thirdly, the proteome in preterm infants would differ from that in term-born infants and a specific protein signature would predict adverse neurodevelopmental outcomes in the preterm infants. vii Methods We analyzed CSF of term infants with HIE, infected and noninfected preterm infants, and term control infants to test these hypotheses. Term infants who were cared for at the neonatal intensive care unit at the Karolinska Hospital in Stockholm due to perinatal asphyxia, between 2000 and 2004, were enrolled prospectively into studies I, III, and IV. Included infants all fulfilled the criteria of perinatal asphyxia and had a lumbar puncture performed on clinical indications. Term infants without asphyxia or any other pathology in the brain who were cared for at the Karolinska Hospital at the same time for suspected infection served as controls. Preterm infants cared for at the neonatal intensive care unit at Karolinska Hospital between 2002 and 2004 and who underwent clinically indicated lumbar puncture were prospectively enrolled into studies II and V. Term infants with suspected infection served as controls. CSF was analyzed from patients and controls. ELISA technique was utilized to measure PGE2 and prostaglandin E2 metabolite (PGEM) in studies I and III and for measuring interleukin 6 (IL-6) and fas-ligand (FasL) in study III. In studies IV and V, proteomic profiling was performed utilizing an antibody affinity-based proteomic array. We measured the relative abundances of 178 unique proteins. The antibodies for the suspension bead array were produced from protein fragments chosen from a protein database for the analysis. Neurological follow-up was performed at 18-24 months in all infants. Results Our main findings were, firstly, that inflammatory biomarkers were increased in CSF in response to both asphyxia and sepsis and had diagnostic as well as prognostic value. Secondly, unique brain-specific proteins were increased in CSF of asphyxiated infants and correlated with the extent of brain injury and clinical outcome. Thirdly, decreased levels of neurodevelopmentally related proteins correlated with unfavorable neurodevelopmental outcomes of preterm infants. More specifically, the inflammatory mediators PGE2 and its more stable metabolite PGEM were found in increased amounts in studies I and II. They had diagnostic value in sepsis and correlated with cardiorespiratory disturbances (study II). In infants who had suffered perinatal asphyxia, they correlated with the HIE degree and the outcome of patients (study I). IL-6 is another inflammatory mediator, that was found in an increased amount in asphyxiated infants in study III and correlated with HIE degree and clinical outcome. In that study, FasL, which is an apoptotic marker and associated viii

with brain cell death in hypoxic-ischemic (HI) brain injury, was found to increase as well and predicted the extent of brain injury and clinical outcome. IL-6 and FasL together predicted HIE degree and outcome with high sensitivity and specificity. Protein profiles in study IV revealed an upregulation of inflammatory pathways as well as other pathways involved in HI brain injury. Several proteins predicted the HIE degree and the clinical outcome of the infants. In study V preterm infants had a different protein profile than term-born infants. Furthermore, depressed levels of several neurodevelopmentally related proteins correlated with adverse outcomes in the preterm group. Conclusion From these results, it may be concluded that several inflammatory- as well as structural and functional brain-specific biomarkers could serve as diagnostic tools in infants at risk of brain injury. Specifically, they could; i) have diagnostic value in HIE and sepsis, ii) help identify infants with HIE grade II and III, who would benefit from neuroprotective treatment after perinatal asphyxia, and iii) have value in predicting the risk of adverse neurological outcomes in infants with HIE and preterm infants. Furthermore, they reflect the injurious processes in HIE and expand the knowledge of the neurodevelopmental processes in the developing brain. This might be important for the invention of future neuroprotective methods.