Functional role of non-coding RNAs and extracellular matrix proteins in developmental processes and breast cancer

Abstract

A better understanding of normal organ development can give deeper insight into which genes are harnessed by aberrant cells during cancer formation and progression. In my thesis, I have investigated two seemingly different, however, related, developmental processes in the breast gland: epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and branching morphogenesis. EMT and its reverse process mesenchymal-to-epithelial transition (MET), are important processes during embryogenesis and in diseases, such as cancer, where evidence suggests that they mediate processes such as cell invasion and formation of metastasis. Branching morphogenesis is an essential developmental process that in the breast gland mostly takes place postnatally. Both processes are widely studied due to their importance in multiple fields. However, the involvement of non-coding RNAs in the regulation of gene expression during EMT and branching morphogenesis has recently been appreciated and is a challenging field of study. In my experimental approach, I mainly took advantage of a well-defined series of cell lines referred to as the D492 cell lines, which include D492, D492M and D492HER2. D492 is a breast progenitor epithelial cell line and a model for branching morphogenesis. D492M is a non-tumorigenic cell line derived from D492 through endothelial-induced EMT, while D492HER2 is a tumorigenic cell line derived from D492 through oncogene-induced EMT. Together, D492 and D492M represent a unique in vitro cellular model, enabling research on the phenotypic and functional changes occurring during EMT, while D492M and D492HER2 allow us to study differences in tumorigenicity. The primary aim of this thesis was to study the expression and functional role of non-coding RNAs during branching morphogenesis and EMT in the human breast gland using the D492 and D492M cell lines. The secondary aim was to study the role of extracellular matrix proteins secreted by D492HER2 on cancer growth and angiogenesis. In paper #I, I addressed the role of non-coding RNAs from the DLK1-DIO3 locus in cellular plasticity, EMT and cancer. Here I used primary cells, cancer patient's cohorts and the D492 cell lines. Using the CRISPRi and CRISPRa approaches, we found out that this locus is a marker of mesenchymal cells and affects the cellular plasticity of adult breast epithelial cells. Paper #II was focused on identifying miRNAs highly upregulated in D492 during branching morphogenesis but downregulated in D492M. We identified MIR203a as a novel suppressor of peroxidasin (PXDN), a collagen IV crosslinking agent. Our results indicate that MIR203a may be an essential regulator of branching morphogenesis and basement remodelling in the human breast gland, likely through its target PXDN. Finally, in paper #III and IV, we compared the two D492 derived cell lines D492M and D492HER2. Compared to D492M, the tumorigenic D492HER2 has a partial EMT phenotype, seen by increased expression of epithelial miRNAs. D492HER2 shows higher migratory, invasive, proliferative and angiogenic properties compared to both D492 and D492M. By means of mass spectrometry and RNA sequencing analysis of D492M and D492HER2, we identified extracellular matrix protein YKL-40 and ECM1 as potential candidates contributing to tumorigenicity of D492HER2 and to be partially responsible for the functional differences between the cell lines. Moreover, we showed that ECM1 induces crosstalk with endothelial cells through Notch signalling. Collectively, I have in my thesis partially uncovered the role of non-coding genes from the DLK1-DIO3 locus and MIR203a in EMT and branching morphogenesis. Furthermore, I have also, in collaboration with my co-workers, identified the ECM proteins YKL-40 and ECM1 as potential inducers of cancer growth and angiogenesis.

Þekking á þroskun og sérhæfingu vefja gefur innsýn í gen og þroskunarferli sem einnig gegna hlutverki við myndun krabbameina og framþróun æxlisvaxtar. Í þessari ritgerð rannsakaði ég RNA sameindir sem ekki tjá fyrir próteinum (e. non-coding RNAs (microRNA og long noncoding RNA, lncRNA)) og hlutverk þeirra í þroskun og sérhæfingu brjóstkirtilsfruma. Ég skoðaði einkum hlutverk þeirra í bandvefsumbreytingu þekjufruma (e. epithelial to mesenchymal transition, EMT) og í greinóttri formgerð (e. branching morphogenesis). Auk þess rannsakaði ég hlutverk utanfrumupróteina í hegðun og svipgerð brjóstrabbameinsfruma og í nýæðamyndun. EMT og þekjuvefsumbreyting bandvefsfruma (e. mesenchymal to epithelial transition, MET) eru mikilvægir ferlar í fósturþroska og í sjúkdómum á borð við krabbamein þar sem þeir hafa verið tengdir við ífarandi vöxt og meinvarpamyndun. Greinótt formgerð í brjóstkirtlinum hefst að mestu við kynþroska kvenna og er kirtilinn í mikilli ummyndun í hverjum tíðarhring fram að tíðahvörfum. EMT og MET gegna mikilvægu hlutverki í myndun greinóttrar formgerðar í brjóstkirtli. Á síðustu árum hefur komið í ljós að non-coding RNAs hafa mikil áhrif á stjórnun EMT og MET þó enn sé margt á huldu varðandi hlutverk einstakra RNA sameinda í þessu ferli. Rannsóknarmódelið sem ég notaði byggir á brjóstþekjufrumulínunni D492 og dótturlínum hennar. D492 er stofnfrumulína sem getur myndað greinótta formgerð í þrívíðri rækt. D492M er bandvefs-lik dótturlína frá D492 sem hefur undirgengist EMT. D492HER2 er einnig komin frá D492, en í þessari dótturlínu er HER2 æxlisgenið yfirtjáð; frumulína þessi getur myndað æxli í músum. Þessar línur hafa allar sama erfðabakgrunn en ólíka svipgerð og eru því hentugar til rannsókna á greinóttri formgerð, EMT og MET í eðlilegum og illkynja brjóstkirtli. Meginmarkmið verkefnisins var að rannsaka tjáningu og hlutverk RNA sameinda sem ekki tjá fyrir próteinum, bæði microRNA og lncRNA, í greinóttri formgerð, EMT og MET í brjóstkirtli. Jafnframt var markmiðið að rannsaka áhrif utanfrumupróteina sem seytt er frá D492HER2 á æxlisvöxt, svipgerð og nýæðamyndun í frumurækt. Í grein I kannaði ég hlutverk RNA sameinda sem eru staðsett á DLK1-DIO3 genasvæðinu (e. gene locus) á litningi 14 í EMT/MET, stjórnun svipgerðar frumna og í brjóstakrabbameinum. Helstu niðurstöður sýndu að RNA sameindir þessar, þar með talið MEG3 lncRNA og microRNA á þessu genasvæði eru meira tjáð í bandvefsfrumum en þekjufrumum og jafnframt að tjáning þessara RNA sameinda hefur áhrif á sérhæfingu brjóstaþekjufruma yfir í bandvefsfrumur. Í grein II var markmiðið að greina tjáningamynstur microRNA sameinda í greinóttri formgerð í þrívíðri rækt og EMT. Niðurstöður okkar sýna að tjáning microRNA 203a jókst margalt við myndun greinóttrar formgerðar í D492 en var lækkuð í D492M bandvefsfrumulínunni. Við sýndum einnig fram á að sameindin bælir tjáningu peroxidasin (PXDN) millifrumupróteinsins. Niðurstöður okkar benda til þess að microRNA203a sé mikilvægur stýrill við myndun greinóttrar formgerðar og í myndun grunnhimnu í brjóstkirtli og þá mögulega í gegnum PXDN. Í grein III og IV var markmiðið að bera saman svipgerð D492 og D492M við D492HER2 frumulínuna sem ólíkt þeim fyrrnefndu myndar æxli í ónæmisbældum músum. Ólíkt D492M, sem hefur sterka EMT svipgerð, þá sýnir D492HER2 einungis EMT svipgerð að hluta (e. partial EMT) og breytir sinni svipgerð eftir ytri aðstæðum, ásamt því að tjá mun meira af þekjuvefstengdum microRNA sameindum en D492M. Auk þess sýnir D492HER2 mun meira skrið og ífarandi vaxtareiginleika en D492M. Með massagreiningu og RNA raðgreiningu greindum við utanfrumupróteinin YKL-40 og ECM1 sem prótein sem mögulega geta stuðlað að krabbameinseiginleikum D492HER2. Jafnframt hafa YKL-40 and ECM1 áhrif á nýmyndun æða í frumuræktunum. Í ritgerð þessari hef ég rannsakað RNA sameindir sem ekki tjá fyrir próteinum frá DLK1-DIO3 genasvæðinu ásamt microRNA203a og hlutverk þeirra í greinóttri formgerð og í krabbameinum og sýnt fram á að þessar RNA sameindir gegna hlutverki í EMT/MET. Jafnframt hef ég unnið að rannsóknum á hlutverki YKL-40 og ECM1 utanfrumupróteinanna í brjóstakrabbameinum og sýnt fram á hlutverk þeirra í í skriði æxlisfruma og í nýæðamyndun.